李 立，劉曄瑋，李紅兵，李 麗，趙劍喜，邸多隆

(1.蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所，甘肅蘭州730000; 2.中國(guó)科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730000; 3.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所，甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730000)

黑莓果渣不同溶劑提取物抗氧化活性研究

李 立1，2，3，劉曄瑋1，*，李紅兵1，2，3，李 麗1，2，3，趙劍喜1，2，3，邸多隆2，3，*

(1.蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所，甘肅蘭州730000; 2.中國(guó)科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730000; 3.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所，甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730000)

黑莓果渣經(jīng)不同溶劑(水、pH3水、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯)在室溫下振搖提取，得到黑莓果渣不同溶劑提取物。分別采用總抗氧化能力測(cè)定體系、DPPH·(1，1-二苯基-2-苦基肼)自由基體系、羥基自由基體系、超氧陰離子自由基體系，對(duì)黑莓果渣不同溶劑提取物總抗氧化能力、清除DPPH·、O-2·和·OH的活性進(jìn)行測(cè)定，并與VC進(jìn)行比較。結(jié)果表明，黑莓果渣不同溶劑提取物均有不同程度抗氧化能力;酸性溶劑提取效果優(yōu)于非酸性溶劑;60%乙醇為最佳的提取溶劑，其提取物總抗氧化能力、清除DPPH·和O-2·活性均弱于VC，而清除·OH活性較強(qiáng)且高于VC。

黑莓，抗氧化，自由基，提取物

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑莓 南京新得力食品有限公司提供，低溫避光保存，臨用前取出，放至室溫;總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定試劑盒 購(gòu)自南京建成生物工程研究所;1，1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH·)標(biāo)準(zhǔn)品、VC標(biāo)準(zhǔn)品 購(gòu)自Sigma公司;雙重蒸餾水 實(shí)驗(yàn)室自制;其它試劑 均為分析純。

CH-8606微量分析天平 Mettler-Toledo公司; SHA-B多功能恒溫振蕩器 江蘇正基儀器有限公司;RE-52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 鞏義市予華儀器有限公司;T6新世紀(jì)紫外-紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑莓果渣不同溶劑提取物的制備 取黑莓榨汁后殘?jiān)?，干燥，過(guò)38目篩去籽得黑莓果渣，分別精密稱(chēng)取適量的黑莓果渣粉末7份，按1g∶20mL比例加入不同提取溶劑(水、pH3水、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯)，在恒溫振蕩器上25℃振搖3h，過(guò)濾，得不同溶劑提取液。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮至近干時(shí)，用少量溶劑轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)皿中，經(jīng)真空干燥(40℃)得黑莓果渣不同溶劑提取物，低溫避光保存，備用。

1.2.2 黑莓果渣總抗氧化能力的測(cè)定 黑莓果渣不同溶劑提取物總抗氧化能力通過(guò)南京新得力食品有限公司提供總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定試劑盒測(cè)定。定義為在37℃時(shí)，每分鐘每毫克浸膏使反應(yīng)體系的吸光度(OD)值每增加0.01時(shí)，為一個(gè)總抗氧化能力單位。

其中:ODU:測(cè)定管吸光度值;ODC:對(duì)照管吸光度值;N:反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)(反應(yīng)體系總體積/取樣量);C:待測(cè)溶液濃度(mg/mL)。

1.2.3 黑莓果渣清除DPPH·活性的測(cè)定［7-8］DPPH·標(biāo)準(zhǔn)液的制備:用甲醇配制濃度為 0.052mg/mL的DPPH·標(biāo)準(zhǔn)品溶液。臨用時(shí)將儲(chǔ)備液稀釋至0.026mg/mL的工作溶液。

精密稱(chēng)取適量黑莓果渣不同溶劑提取物，用乙醇溶解(超聲助溶)，根據(jù)其活性強(qiáng)弱將其稀釋至一定濃度，分別取1、2、4、6、8mL，用95%乙醇稀釋至10mL。分別移取上述不同濃度的樣品溶液2mL，加入2mL上述DPPH·標(biāo)準(zhǔn)溶液，使總體積為4mL，即為樣品反應(yīng)溶液。精密量取乙醇2mL，加入DPPH·溶液2mL，使總體積為4mL，即為空樣溶液。精密量取2mL樣品溶液，加入2mL甲醇，使總體積為4mL，即為空白溶液。分別將樣品溶液、空樣溶液和空白溶液混勻后，在室溫避光反應(yīng)30min后，在517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，得到A樣品、A空樣和A空白。按式(2)計(jì)算樣品對(duì)DPPH·自由基清除率。

1.2.4 黑莓果渣清除·OH活性的測(cè)定［9-10］精密稱(chēng)取適量的黑莓果渣不同溶劑提取物和VC標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制成一定濃度的溶液。首先向反應(yīng)試管中依次加入0.5mL 5.0mmol/L鄰二氮菲溶液、2mL磷酸鹽緩沖溶液(pH7.40)，充分混勻后，加入1mL 2.5mmol/L FeSO4水溶液后混勻，然后加入0.5mL 0.1%的雙氧水溶液，加水稀釋至5mL。于37℃恒溫水浴中反應(yīng)60min后，在536nm測(cè)其吸光度作為損傷管，記為AS。同上操作，不加雙氧水溶液測(cè)吸光值作為未損傷管，記為AW。加入1mL樣品后再加雙氧水操作作為樣品管，測(cè)吸光度為AY。按式(3)計(jì)算樣品對(duì)·OH的清除率:

式中:ΔA和ΔA0分別表示加入樣品和水后的鄰苯三酚自氧化速率，即每分鐘吸光度的平均變化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸膏得率和總抗氧化能力

黑莓果渣不同溶劑提取物浸膏得率及總抗氧化能力見(jiàn)表1。由表1可知，pH3水提物浸膏得率最高，達(dá)到了48%以上;水、60%乙醇和80%乙醇提取物浸膏得率次之，為43%左右;正丁醇與乙酸乙酯提取物浸膏得率最低。由表1可知，黑莓果渣不同溶劑提取物中，60%乙醇提取物總的抗氧化能力最強(qiáng)，達(dá)到9.67個(gè)單位。黑莓果渣不同溶劑提取物總抗氧化能力強(qiáng)弱順序?yàn)?60%乙醇提取物＞80%乙醇提取物＞pH3水提取物＞正丁醇提取物＞水提取物＞95%乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物。

表1 不同溶劑提取物浸膏得率、總抗氧化能力及綜合指標(biāo)

2.2 清除DPPH·活性

黑莓果渣不同溶劑提取物清除DPPH·活性見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，各提取物濃度與其清除率之間存在一定的量效關(guān)系。黑莓果渣不同溶劑提取物清除DPPH·活性均低于VC，黑莓果渣不同溶劑提取物中60%乙醇提取物清除DPPH自由基活性最強(qiáng)，IC50達(dá)到0.045mg/mL左右。各溶劑提取物清除DPPH·活性強(qiáng)弱順序?yàn)?VC＞60%乙醇提取物＞pH3水提取物＞80%乙醇提取物＞水提取物＞95%乙醇提取物＞正丁醇提取物＞乙酸乙酯提取物。

圖1 不同溶劑提取物清除DPPH·活性

2.3 清除·OH活性

黑莓果渣不同溶劑提取物清除·OH活性見(jiàn)圖2。在0.25～1.25mg/mL濃度范圍內(nèi)，60%乙醇、80%乙醇和 pH3水提物清除活性均強(qiáng)于 VC，在濃度1.25mg/mL時(shí)60%乙醇提取物清除率達(dá)到100%。同時(shí)可以看出，在0.25～1.25mg/mL濃度范圍內(nèi)，pH3水提物的清除率要高于單純水提取物，這說(shuō)明pH3水提物活性要高于水提物。對(duì)不同溶劑提取物清除·OH活性強(qiáng)弱總的排序?yàn)?60%乙醇提取物＞80%乙醇提取物＞pH3水提取物＞95%乙醇提取物＞VC＞水提取物。

圖2 不同溶劑提取物清除·OH活性

2.4 清除O-2·活性

黑莓果渣不同溶劑提取物清除O2-·活性見(jiàn)圖3。由圖3可知，各提取物清除活性強(qiáng)弱依次為:VC＞60%乙醇提取物＞pH3水提取物＞水提取物＞95%乙醇提取物＞80%乙醇提取物。黑莓果渣不同溶劑提取物清除O2-·活性要明顯弱于VC;pH3水提取物清除活性要強(qiáng)于水提取物活性。

圖3 不同溶劑提取物清除物O-2·活性

2.5 加權(quán)法評(píng)價(jià)

通過(guò)加權(quán)法綜合總抗氧化能力和浸膏得率來(lái)篩選最佳的提取黑莓果渣中抗氧化活性物質(zhì)的溶劑。由于總抗氧化能力是反映提取物抗氧化效果主要的指標(biāo)，故將總抗氧化能力權(quán)重設(shè)定為0.6;浸膏得率也是反映提取效果的一個(gè)重要方面，將其權(quán)重設(shè)定為0.4。按式(5)計(jì)算不同溶劑提取效果的綜合指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表1。

綜合指標(biāo)=(浸膏得率/浸膏得率最大值×0.4+總抗氧化能力/總抗氧化能力最大值×0.6)×100%式(5)

3 結(jié)論

3.1 由于乙酸乙酯和正丁醇提取物在反應(yīng)液中很難溶解，故在清除·OH和O2-·活性測(cè)定中剔除。根據(jù)實(shí)驗(yàn)和分析，結(jié)果表明，黑莓果渣不同溶劑提取物均具有不同程度的總抗氧化能力和清除DPPH·、·OH、O2-·活性;60%乙醇提取物總抗氧化能力和自由基清除活性均為各測(cè)定提取物中最強(qiáng)，其清除·OH活性較好，且高于VC;但其總抗氧化能力、清除DPPH·活性和清除O2-·活性均要低于同等濃度的VC，推測(cè)一方面由于粗提取物中有效活性物質(zhì)的含量大大低于純的VC標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)提取物中存在的大量多糖和果膠成分也抑制了活性的發(fā)揮［11］。

3.2 比較pH3水提物與水提物清除自由基活性和總抗氧化能力發(fā)現(xiàn)，提取溶劑酸堿值為影響黑莓果渣提取效果的因素，酸性溶劑提取效果較佳，這主要是由于VC和花色苷成分在堿性、中性環(huán)境容易破壞，而在酸性條件下穩(wěn)定性較好［12-13］。

3.3 通過(guò)加權(quán)法綜合總抗氧化能力和浸膏得率篩選出60%乙醇為最佳的黑莓果渣抗氧化物質(zhì)提取溶劑。這與60%乙醇提取物清除DPPH·、·OH、·活性為所測(cè)提取物中活性最強(qiáng)的結(jié)果相一致。

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Study on antioxidant activity of different solvents extracts from blackberry pomaces

LI Li1，2，3，LIU Ye-wei1，*，LI Hong-bing1，2，3，LI Li1，2，3，ZHAO Jian-xi1，2，3，DI Duo-long2，3，*
(1.Institute of Nutrition and Food Hygiene，College of Public Health，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China; 2.Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources，Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730000，China; 3.Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province，Lanzhou Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730000，China)

The blackberry pomaces was vibrational extracted using different solvent including aqueous，aqueous (pH3)，60%ethanol，80%ethanol，95%ethanol，n-butanol and ethyl acetate in room temperature，respectively. And then the different extracts were obtained.The total antioxidant activity，the·OH antioxidant capacity，O-2· and DPPH· free radical scavenging capacity of the different extracts were determined spectrophotometrically using the total antioxidant capacity assay system，DPPH· system，hydroxyl radical system，superoxide radical system.The results showed that all the extracts from the blackberry pomaces had antioxidant activity and free radical scavenging activity.The acidic solvent had better effect than non-acidic solvent.The 60%ethanol was the appropriate solvent.And the total antioxidant capacity，scavenging capacity to O-2·and DPPH·of 60%ethanol extract were all weaker than VC，but the scavenging capacity to·OH was stronger than VC.

blackberry;antioxidant;radical;extract

TS255.1

A

1002-0306(2011)03-0116-04

黑莓(Blackberry)為薔薇科懸鉤子屬植物，果汁主要用于制作甜點(diǎn)、果醬、果凍、果酒和飲料等［1］。在工業(yè)加工中會(huì)產(chǎn)生大量殘?jiān)饕谳秃谳?。工業(yè)上常將黑莓籽榨油，而將黑莓果渣廢棄。研究表明，黑莓果渣中含有豐富的多酚類(lèi)化合物和維生素，其提取物具有較好的抗氧化能力［2］，如將其作為抗氧化活性物質(zhì)提取原料加以利用，可變廢為寶，且資源豐富。Ingrid Elisia等對(duì)黑莓80%乙醇提取物中花色苷含量和抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，其花色苷成分可以抑制過(guò)氧化氫自由基對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的氧化，并且花色苷含量與抗氧化能力存在很強(qiáng)相關(guān)性［3］。焦中高等對(duì)黑莓果實(shí)水提物還原能力、抗脂質(zhì)過(guò)氧化和抑制鄰苯三酚自氧化三個(gè)方面進(jìn)行了抗氧化活性的測(cè)定，顯示黑莓紅色素可有效抑制亞油酸的過(guò)氧化和鄰苯三酚自氧化［4］。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，其對(duì)亞油酸過(guò)氧化和鄰苯三酚自氧化的最大抑制率分別可達(dá)98.70%和84.52%。陳欣欣等將榨汁后黑莓殘?jiān)?∶10的料液比加入含有1%檸檬酸的不同濃度的乙醇溶液攪拌提取得到提取物，對(duì)其總多酚含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果證明，50%乙醇溶液提取物總酚含量最高［5-6］。本研究選用不同溶劑對(duì)黑莓果渣(去籽部分)進(jìn)行提取，得到不同粗提物，通過(guò)對(duì)黑莓果渣不同溶劑提取物總的抗氧化能力(T-AOC)和清除DPPH·、·OH、O2-·活性的測(cè)定，來(lái)綜合評(píng)價(jià)不同溶劑提取物抗氧化活性，并篩選出最佳的提取溶劑，為更好地利用黑莓果渣提供參考。

2010-02-05 *通訊聯(lián)系人

李立(1984-)，男，碩士研究生，主要從事食品營(yíng)養(yǎng)功效成分篩選研究。

甘肅省自然科學(xué)基金(096RJZA058);中國(guó)科學(xué)院“百人計(jì)劃”擇優(yōu)項(xiàng)目。