胡長鷹，于文喜

（暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州510632）

山藥皂苷及其對離體心臟缺血再灌注損傷的保護作用

胡長鷹，于文喜

（暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州510632）

目的：從山藥中分離得到水溶性皂苷，研究其抗心血管疾病功效。方法：利用水煮法提取、乙酸乙酯和正丁醇萃取、反相層析技術從山藥中分離皂苷，用1H-NMR、13C-NMR、135DEPT、HMQC和HMBC等方法鑒定其結構。30只大鼠隨機分成3組：對照組、缺氧/復氧（I/R）組和山藥皂苷樣品處理組。建立對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷模型，通過對比左室舒張期末壓、左室發(fā)展壓、左室內壓上升的最大速率、左室內壓下降的最大速率、心肌單向動作電位和乳酸脫氫酶的變化，研究該皂苷是否對大鼠離體缺血再灌注損傷的心臟具有保護作用。結果：從新鮮的山藥根莖中得到（25R）-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-呋甾烷-5-烯-3β，22ξ-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基（1→3）-β-D-吡喃葡萄糖基（1→4）-［α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）］-β-D-吡喃葡萄糖苷，該成分對大鼠離體缺血再灌注損傷的心臟具有顯著的保護和修復作用。結論：該化合物為含有5個糖基的雙糖鏈水溶性甾體皂苷，具有抗心血管疾病的功效。

山藥，甾體皂苷，缺血再灌注損傷，離體心臟

1 材料與方法

1.1 材料與設備

新鮮山藥 購于農貿市場；無水乙醇、丙酮、硫酸、茴香醛、冰醋酸、甲醇、石油醚（30～60℃）、正丁醇分析純級，上海化學試劑有限公司；GF254硅膠板山東煙臺芝罘化工廠；大孔吸附樹脂AB-8 南開大學化工廠生產；MCI、ODS柱填料 進口分裝，由北京綠百草科技發(fā)展有限公司提供；LDH試劑盒 東甌津瑪生物科技有限公司；戊巴比妥鈉 美國Sigma公司；混合氣體（95%O2+5%CO2） 廣州氣體廠有限公司；Langendorff灌流所用Krebs-Henseleit緩沖液（K-H液） 自配，成分如下（mmol/L）：NaCl 118.4、KCl 4.7、KH2PO41.18、MgSO41.1、NaHCO324.5、CaCl22.55、Glucose 11.1，pH 7.2～7.4。健康雄性Spraugue-Dawley（SD）大鼠 體重250～280g，由廣東省實驗動物中心提供，動物常規(guī)喂養(yǎng)3～5d后開始實驗。

Buker Avance 500MHz核磁共振儀 中科院上海有機化學研究所提供；WFJ8-20中藥粉碎機 江陰市靈杏藥化設備有限公司；旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；BL-420S生物信號采集系統(tǒng) 成都泰盟科技有限公司；臺式血壓計 上海醫(yī)療設備廠；7600全自動生化分析儀 日本日立公司；改良Langendorff灌流裝置。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取與分離 取10kg新鮮的山藥根莖，切片，用沸水在料液比為1∶4的條件下，提取3次，共煮沸提取6h；將提取液先用4層紗布過濾，再抽濾除去不溶性雜質，在減壓條件下濃縮，即可得薯蕷皂苷的水提取物。用三倍體積的乙酸乙酯萃取直到乙酸乙酯相無色以除去弱極性物質，繼續(xù)用水飽和正丁醇提取直到正丁醇相無色以除去中等和較大極性物質，剩余部分經濃縮至適當體積后作水相。

將水相部分上AB-8大孔吸附樹脂柱（80× 1500mm），先用300mL去離子水洗脫除去水溶性蛋白質及多糖類物質，然后用20%～30%的乙醇梯度洗脫，每50mL收集一份，以正丁醇∶冰醋酸∶水（5∶1∶4）為展開劑，以茴香醛-硫酸溶液為顯色劑，經TLC鑒定，Rf相同的洗脫液合并，分成A、B兩部分，將A部分上ODS柱（60×600mm），先用200mL去離子水洗脫，再用20%乙醇梯度洗脫，TLC鑒定，選擇其中1個含量較高的物質進行純化，收集洗脫液濃縮至一定體積后再分別反復上 ODS和 MCI柱（30× 450mm），用20%的乙醇溶液洗脫，20mL收集一管，經TLC鑒定純度。洗脫流速均為1.0mL/min。直到得到1個純化合物，稱為化合物A。

1.2.2 結構鑒定 將所得化合物 A用氘代吡啶（pyridine-d5）溶解后利用核磁共振技術鑒定其結構。

1.2.3 化合物對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷作用實驗

1.2.3.1 實驗分組 將雄性SD大鼠隨機分為3組，每組10只。對照（Control）組：離體心臟灌流至心率和心電正常后正常灌注90min；缺氧/復氧（I/R）組：離體心臟預灌注 30min后，停灌 20min，再復灌40min；薯蕷樣品（A）處理組：離體心臟預灌注30min后，停灌20min，再復灌40min。A處理組在復氧時于灌注液中加入50mg/L化合物A。

1.2.3.2 實驗步驟 以 1.0% 戊巴比妥鈉（30～35mg/kg，ip）麻醉大鼠，迅速開胸摘取心臟并置于0～4℃的K-H液中制動，沖洗冠脈中的血液。主動脈插管，迅速將心臟懸掛于Langendorff裝置上，在恒溫（37℃）下，以95%O2+5%CO2充分飽和的K-H液進行逆行灌注。心臟復跳后，平衡2～3min，將左心耳剪一小口，沿左心房將充水乳膠球囊插入左心室并固定，乳膠球囊與壓力傳感器相連。以K-H液預灌至心臟恢復正常跳動后開始實驗。預灌時HR＜220bpm（心跳數(shù)）和LVSP（左室收縮壓）＜60mmHg的心臟棄去不用。

1.2.3.3 缺氧/復氧模型 心臟預灌注30min，停止灌流20min，復灌40min，經BL-420S生物信號采集系統(tǒng)記錄缺氧前及復氧20、30、40min不同時間的左心室壓力波形。

1.2.3.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0版統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計處理，所有計量資料均用均數(shù)±標準誤（s）表示。

2 結果與討論

2.1 化合物結構

得到一種化合物A 19.22g。該化合物為白色無定型粉末，溶于甲醇、乙醇，極易溶于水。

1H-NMR譜：二個單峰甲基δH0.98和1.13；三個雙峰甲基δH1.06（3H，d，J=6.7Hz），1.40（3H，d，J= 6.7 Hz）和 1.79（3H，d，J=5.9Hz）；一個雙鍵氫δH5.39；五個端基質子信號δH6.26（1H，s），5.24（1H，d，J=7.6Hz），5.14（1H，d，J=7.6Hz），5.03（1H，d，J= 7.5Hz）和4.95（1H，d，J=7.7Hz）。

13C-NMR譜：共有57個碳信號，其中皂苷元有27個碳信號，30個為糖基上碳信號。δC111.0為一個季碳信號，δC122.1和141.2為烯碳信號，表明該化合物為甾體皂苷。與薯蕷皂苷元相比［3-4］，其余信號相似，而其C-26的化學位移值由δC67左右向低場移動至δC75.4，說明該化合物為薯蕷皂苷元的F環(huán)開環(huán)，并形成糖苷。該化合物的皂苷元部分為原薯蕷皂苷元。

13C-NMR譜：有5個端基碳信號δC106.1，105.1，104.7，101.9和100.1，表明有5個糖基存在。HMBC譜顯示δH4.91的質子與C-26（δC75.4）相關，說明δH4.91的端基質子的糖與皂苷元的C-26相連。通過TOCSY和HMQC譜的解析，可對糖鏈上質子與碳信號進行進一步歸屬。

通過以上分析并參照文獻［3，5-6］，化合物A為（25R）-26-O-β-D-glucopyranosyl-furost-5-en-3β，22ξ-diol-3-O-β-D-glucopyranosyl（1→3）-β-D -Glucopyranosyl（1→4）-［α-L-rhamnopyranosyl（1→2）］-β-D-glucopyranoside。

2.2 化合物抗心血管疾病功效

2.2.1 化合物A對缺氧/復氧心臟左室舒張期末壓（LVEDP）的影響 表1結果表明，缺氧/復氧后，大鼠心臟LVEDP明顯高于Control組，表明左心室舒張功能下降，且差異極顯著（P＜0.01）。復氧20、30、40min A+I/R組的LVEDP與I/R組相比明顯下降，差異極顯著（P＜0.01），表明化合物A可部分修復離體大鼠心臟I/R造成的心肌舒張功能障礙。

表1 化合物A對缺氧/復氧心臟左室舒張期末壓（LVEDP）的影響

表2 化合物A對I/R損傷大鼠離體心臟左室發(fā)展壓（LVDP）的影響

表3 化合物A對I/R損傷大鼠離體心臟左室內壓上升的最大速率（dp/dtmax）的影響

表4 化合物A對I/R損傷大鼠離體心臟左室內壓下降的最大速率（dp/dtmin）的影響

圖1 化合物A結構

2.2.2 化合物A對I/R損傷大鼠離體心臟左室發(fā)展壓（LVDP）的影響 表2實驗結果：復氧20、30、40min A+I/R組的LVDP與I/R組相比明顯升高，差異極顯著（P＜0.01），表明化合物A可顯著修復離體大鼠心臟I/R造成的心肌收縮功能障礙。

2.2.3 化合物A對I/R損傷大鼠離體心臟左室內壓上升的最大速率（dp/dtmax）和左室內壓下降的最大速率（dp/dtmin）的影響 表3、表4實驗結果：預灌注末期各組大鼠心臟dp/dtmax、dp/dtmin無顯著性差異。缺氧/復氧使離體大鼠心臟dp/dtmax明顯降低，其中單純I/R組dp/dtmax降低的幅度最大，隨著復氧時間的延長，I/R組無明顯回升，與Control組差異顯著（P＜ 0.01）?；衔顰處理可明顯使I/R心臟dp/dtmax升高，復氧至40min時，其dp/dtmax不再有明顯上升趨勢，但與單純I/R組相比有顯著性差異（P＜0.01）。缺氧/復氧后，大鼠心臟 dp/dtmin與control組相應時點比較顯著降低（P＜0.01），化合物A可顯著升高缺氧/復氧大鼠心臟的 dp/dtmin（P＜0.01），并且接近control組水平，說明化合物A對dp/dtmax和dp/dtmin指標的修復功能很好。

2.2.4 化合物A對I/R損傷大鼠離體心臟心肌單向動作電位（MAP）的影響 表5實驗結果：缺氧/復氧使大鼠心臟MAP明顯降低，其中單純I/R組MAP降低的幅度隨復氧時間延長沒有好轉，復氧40min時為6.72±1.53mv，化合物A處理可明顯升高缺氧/復氧心臟MAP，雖不能達到control組水平，但與單純I/R組相比有差異（P＜0.05），說明化合物A對MAP有修復功能。

2.2.5 化合物A對I/R損傷大鼠離體心臟冠脈流出液中乳酸脫氫酶（LDH）含量的影響 表6實驗結果：缺氧/復氧使離體心臟冠脈流出液中的LDH含量明顯升高（P＜0.01），而化合物A可顯著降低缺氧/復氧心臟冠脈流出液中LDH含量（P＜0.01），但不能回復到損傷前的狀況。

3 結論

從新鮮的山藥中分離得到一種含有5糖的雙糖鏈水溶性甾體皂苷A，結構為（25R）-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-呋甾烷-5-烯-3β，22ξ-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基（1→3）-β-D-吡喃葡萄糖基（1→ 4）-［α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）］-β-D-吡喃葡萄糖苷。通過對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護作用實驗研究表明，該化合物對因缺血再灌注損傷的心臟具有保護和修復作用，結合文獻［2，7-8］研究結果可以說明，雙糖鏈水溶性甾體皂苷具有治療心血管疾病的功效，值得開發(fā)利用。雙糖鏈水溶性甾體皂苷的作用機理及構效關系值得進一步研究。

表5 化合物A對I/R損傷大鼠離體心臟心肌單向動作電位（MAP）的影響

表6 化合物A對I/R損傷大鼠離體心臟冠脈流出液中乳酸脫氫酶（LDH）含量的影響

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Protection to ischemia reperfusion injury in rats isolated hearts of steroidal saponin from Dioscorea batatas

HU Chang-ying，YU Wen-xi
（Depertment of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Objective：To isolate the water-soluble steroidal saponin from Dioscorea batatas and to assess its effectiviness of anti-cardiovascular disease.Methods：The fresh rhizome of Dioscorea batatas was extracted with boiling water and then was extracted with ethyl acetate and n-butanol fraction.The water fraction was isolated by the reversed-phase ODS and MCI column chromatography.The chemical structure was elucidated by means of1H-NMR，13C-NMR，135DEPT，HMQC and HMBC spectroscopic analyses.30 SD rats were randomly divided into three groups：control group（n=10），I/R group（n=10），and saponin preconditioning group（n=10）followed by I/R induction（SY-1）.The following parameters were measured and analyzed：LVEDP，LVDP，dp/dtmax，dp/dtmin，MAP and LDH.Results：One steroidal saponin was isolated from the fresh Dioscorea batatas and its compound was identified as（25R）-26-O-β-D-glucopyranosyl-furost-5-en-3β，22ξ-diol-3-O-β-D-glucopyranosyl（1→3）-β-D-glucopyranosyl（1→4）-［α-L-rhamnopyranosyl（1→2）］-β-D-glucopyranoside.The results showed this compound greatly improved the protecting of I/R injury of isolated hearts in rats.Conclusion：This compound is a water-soluble steroidal saponin with five sugar moieties，double sugar chains.It contributes the great effectivities of anti-cardiovascular disease.

Dioscorea batatas；steroidal saponin；ischemia reperfusion（I/R）injury；isolated heart

TS201.4

A

1002-0306（2011）02-0309-04

山藥（Dioscorea batatas）屬薯蕷科多年蔓生草本植物薯蕷的塊莖，又稱淮山、淮山藥、懷山藥等，含有豐富的蛋白質、維生素和糖類、多種氨基酸、礦質營養(yǎng)成分等，營養(yǎng)豐富，是物美價廉的藥食兩用佳品。在對山藥的實驗研究中分離得到了一種強極性的雙糖鏈水溶性甾體皂苷?，F(xiàn)有研究表明，甾體皂苷主要分布于薯蕷科植物，具有抗心血管疾病作用［1-2］。本文確定了該皂苷的結構，并初步研究其對抗心血管疾病的功效，以利于更好地認識山藥的功效，更好地開發(fā)利用山藥資源。

2009-09-29

胡長鷹（1968-），女，博士，副教授，研究方向：天然產物提取與功能性食品、食品包裝與安全等。

珠海市科技攻關項目（PC20071044）。