孫希云，劉 寧，吳朝霞，張 琦，孟憲軍，*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110161；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，遼寧沈陽110161）

紅樹莓色素的純化及成分初步鑒定

孫希云1，劉 寧2，吳朝霞1，張 琦1，孟憲軍1，*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110161；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，遼寧沈陽110161）

以紅樹莓果實為原料提取天然色素，采用大孔樹脂法對樣品進行純化，純化后樣品采用紙層析法分離，同時運用紫外可見光譜法和紙層析法對各組分進行了初步鑒定。結(jié)果表明：HPD-700大孔吸附樹脂較適宜用于純化紅樹莓色素，粗提液pH為2時吸附效果較好，以60%乙醇為洗脫液、洗脫體積為4BV、流速為0.6mL/min進行洗脫時，洗脫效果較好；通過紙層析分離出四個組分，初步鑒定分別為矢車菊-3-葡萄糖苷、矢車菊-3-蕓香糖苷、矢車菊-3-槐糖苷和矢車菊-3-葡萄糖-蕓香糖苷。

紅樹莓，色素，大孔樹脂，紫外光譜，紙層析

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅樹莓 采自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院樹莓園，品種為美紅22；大孔吸附樹脂 HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-450、HPD-700，滄州寶恩化工有限公司；AB-8、DA-201、DM-301、S-8、X-5 南開大學(xué)化工廠；果膠酶（≥6萬U/mL） 食品級，河南雅大科技有限公司；新華3號層析紙 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、乙醇、正丁醇等試劑 均為分析純。

電熱恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HL-2恒流泵、BSZ-100自動部分收集器、層析柱（2cm×30cm） 上海滬西分析儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 紅樹莓色素提取→純化（大孔樹脂）→分離（紙層析法）→鑒定（紙層析法，紫外可見光譜法）

1.2.2 色素提取 精確稱取300g紅樹莓原料，將原料加水定容到1000mL，然后在50℃的水浴鍋中水浴60min提取，抽濾，加入100mg果膠酶，沉淀12h，抽濾，濃縮，得到粗提液。

1.2.3 色素純化 首先進行樹脂活化，通過靜態(tài)吸附解析實驗確定最適宜純化樹脂。通過動態(tài)吸附解析確定純化的最適宜參數(shù)，同時得到純化樣品。

靜態(tài)吸附解析：稱取10種不同型號的樹脂各2g，分別置于150mL的三角瓶中，加入50mL紅樹莓色素提取液，置于恒溫振蕩器中，30℃、120r/min振蕩24h，使樹脂達到吸附平衡，根據(jù)吸附前后在樹莓色素最大吸收波長處溶液的吸光值（A512nm），計算吸附率。在濾除溶液后的樹脂中加入30mL解吸劑，振蕩至解吸達到平衡，測定解吸后溶液的吸光值（A512nm）。

吸附率（%）=（初始吸光值-吸附后吸光值）/初始吸光值×100%

解吸率（%）=解吸后吸光值/（初始吸光值-吸附后吸光值）×100%

動態(tài)吸附解析：調(diào)整粗提液的pH，上樹脂柱進行吸附，當(dāng)吸附平衡時，測流出液的吸光值，計算吸附率?？疾觳煌琾H條件下樹莓色素粗提液吸附效果。查閱文獻及初步預(yù)實驗，確定影響大孔吸附樹脂吸附解析的主要因素——乙醇濃度、洗脫體積和洗脫速度，設(shè)置不同水平，進行三因素三水平正交實驗設(shè)計，篩選出樹莓色素的最佳吸附解析條件。

表1 L9（33）正交實驗設(shè)計因素水平表

1.2.4 色素分離 在大孔樹脂最佳吸附解吸條件下進行色素的純化，純化后提取液用紙層析法進行樣品分離：在新華3號層析紙上，距長邊2cm處畫點樣線，用毛細管點樣，以BAW為展開液，用酸性甲醇液洗脫，即可分離得到樣品［2］。

1.2.5 結(jié)構(gòu)鑒定 主要采用紫外可見光譜法與紙層析法。

紫外可見光譜法通常用以下幾種方法：a.花色苷最大吸收波長在可見光區(qū)的500～540nm附近，通過測定色素的最大吸收波長即可判斷是否為花色苷類色素。b.如果向花色苷的0.01%鹽酸甲醇溶液中滴加3～5滴AlCl3甲醇或乙醇溶液，出現(xiàn)藍移，即最大吸收波長增加，說明B-環(huán)有鄰位酚羥基，即可區(qū)分B-環(huán)無鄰位酚羥基的天竺葵色素、芍藥色素、錦葵色素和B-環(huán)有鄰位酚羥基的矢車菊色素、牽?；ㄉ?、飛燕草色素。c.根據(jù)花色苷最大吸收波長處的吸光度和440nm處的吸光度的比值A(chǔ)440/Amax，參考相關(guān)的文獻，可以判斷糖苷的位置。d.根據(jù)花色苷在300～330nm間有無吸收峰可判斷該色素分子是否有?；?，如果有吸收峰，表明該色素有?；嬖?。根據(jù)花色苷在紫外光下是否有熒光，可判斷該色素是否在5號位有取代基，如果有熒光則表明該色素在5號位有取代基。

紙層析法展開劑：BAW（正丁醇-乙酸-水= 4∶1∶5）、BH（正丁醇-2mol/L鹽酸=1∶1）、1%鹽酸（濃鹽酸-水=3∶97）、Bu-HCl（冰醋酸∶濃鹽酸∶蒸餾水=15∶3∶82）［3］。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅樹莓色素最大吸收波長的確定

在200～800nm下對紅樹莓色素提取溶液進行全波長掃描，結(jié)果如圖1所示。

圖1 紅樹莓色素紫外吸收光譜圖

由圖1可知，紅樹莓色素提取液在512nm下呈現(xiàn)明顯的最大吸收峰，這與文獻［4］報道較為接近，故確定紅樹莓色素的最大吸收波長為512nm。

2.2 大孔樹脂純化紅樹莓色素

2.2.1 最佳大孔吸附樹脂的選擇 實驗所用的10種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附率及解吸率見表2。

由表2可知，HPD-100、HPD-700、AB-8的吸附率均大于或等于89%，說明它們有很強的吸附能力；而HPD-300、S-8的吸附率分別為67%、61%，說明紅樹莓色素在這兩種樹脂上難以吸附。在解吸方面，S-8的解吸率大于70%，易于解吸；HPD-100、AB-8、DA-201、DM-301的解吸率不及35%，說明它們對于樹莓色素的解吸效果不好。綜合考慮，選擇HPD-700進行后續(xù)實驗。

表2 10種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附率及解吸率

2.2.2 pH對HPD-700樹脂柱吸附效果的影響 在流速為1.2mL/min的條件下，用稀鹽酸、氫氧化鈉溶液調(diào)整紅樹莓色素粗提液的pH，考察pH為1、2、3、4、5、6、7時樹脂對紅樹莓色素吸附效果，結(jié)果如圖2所示。

考察不同pH條件下HPD-700樹脂對紅樹莓色素吸附效果的影響，發(fā)現(xiàn)不同的pH對吸附效果的影響很大，在pH為2時，吸附率最大。這可能是由于紅樹莓色素分子結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，在較高的pH條件下增加了在水中的溶解度，從而降低了樹脂在水溶液中對色素的吸附能力。而當(dāng)pH為2時，吸附效果最好。

圖2 pH對樹脂吸附的影響

2.2.3 HPD-700大孔吸附樹脂對樹莓色素的解吸條件篩選 設(shè)定吸附條件為：流速為1.2mL/min、pH為2。吸附后，通過乙醇溶液的濃度、體積、流速進行三因素三水平的正交實驗對解吸條件進行篩選，結(jié)果如表3所示。

表3 正交實驗結(jié)果分析

在所設(shè)計的9組實驗中，第二組色素的解吸率最大，達71%。通過對正交表進行極差分析，得到各因素對HPD-700大孔吸附樹脂動態(tài)解吸的影響力依次為：乙醇濃度＞洗脫體積＞流速；此實驗條件下的最佳解吸條件：A1B2C1，即乙醇濃度60%，洗脫體積4BV，流速0.6mL/min，此組合不在上述9組實驗之列。

2.2.4 最佳解吸條件驗證實驗結(jié)果 為進一步驗證最佳解吸條件，進行最佳解吸條件即乙醇濃度60%，洗脫體積4BV，流速0.6mL/min條件下的重復(fù)實驗，結(jié)果見表4。

表4 最佳解吸條件驗證結(jié)果

由表4可知，最佳解吸條件下，色素解吸率大于正交實驗的9組數(shù)據(jù)，確為實驗條件下的最佳解吸條件，故最終選擇解吸條件為：A1B2C1，即以60%乙醇為洗脫液、乙醇體積為4BV、流速為0.6mL/min。

2.3 紅樹莓色素成分的分離

大孔樹脂純化后的紅樹莓色素提取液濃縮后經(jīng)BAW溶液進行上行紙層析分離后，能明顯分辨出4個斑點，且色斑呈桔紅色，分開較清晰，由上而下編號為1號、2號、3號和4號。食品中6種主要紅色素衍生物的顏色從桔紅到紫紅按結(jié)構(gòu)順序排列為天竺葵素、矢車菊素、芍藥色素、錦葵素、牽?；ㄋ睾惋w燕草素。因此，從色斑顏色看，1號到4號色素帶可能是天竺葵素、矢車菊素或芍藥色素的衍生物。

2.4 紅樹莓色素成分的初步鑒定

2.4.1 紫外-可見光光譜數(shù)據(jù)比較 向制得的4個純樣色素組的0.01%鹽酸甲醇溶液中滴加3～5滴AlCl3甲醇溶液，都出現(xiàn)紅移現(xiàn)象，說明B-環(huán)有鄰位酚羥基，且位移波長非常接近，所以可判斷四組色素均可能為矢車菊素衍生物，結(jié)果如表5所示。

表5 AlCl3作用前后!man紅移情況

根據(jù)花色苷440nm處的吸光度和最大吸收波長處的吸光度的比值A(chǔ)440/Amax，結(jié)合參考相關(guān)的文獻，可以判斷糖苷的位置。根據(jù)F.J.Francis的結(jié)論，即單一花色苷（3號位置）在0.1%HCl-甲醇溶液中，其A440/Amax比值一般大于20%；而雙取代的花色苷（3、5號位置）在0.1%HCl-甲醇溶液中A440/Amax比值一般小于20%。由表6可判斷，紅樹莓果實中色素所含的花色苷種類均為矢車菊素的衍生物，且3號位置上面有取代，5號位上羥基未被苷化。

表6 四組色素組分的光譜數(shù)據(jù)

四組色素均于300～330nm處無吸收且紫外光下熒光反應(yīng)呈陰性，說明四種色素組分分子內(nèi)無?；?，且在5位無取代基。

2.4.2 紙層析鑒定結(jié)果 紙色譜展開后測量并計算色素斑的Rf值，參考文獻［10］做對照，結(jié)果見表7。

根據(jù)以上分析可初步確定1號色素為矢車菊素-3-葡萄糖苷，2號為色素矢車菊素-3-蕓香糖苷，3號色素為矢車菊素-3-槐糖苷，4號色素為矢車菊素-3-葡萄糖-蕓香糖苷。

3 結(jié)論

3.1 HPD-700大孔吸附樹脂較適宜用于純化紅樹莓色素，純化的適宜條件為：粗提液pH為2時吸附效果較好；以60%乙醇為洗脫液、乙醇體積為4BV、流速為0.6mL/min為解吸條件進行洗脫，洗脫效果較好。

表7 四個色素組分的Rf值及文獻中標(biāo)準(zhǔn)值［10］

3.2 樹莓色素提取液經(jīng)大孔樹脂純化后經(jīng)紙層析分離出四個色素組分，通過紫外光譜、紙層析可初步確定紅樹莓色素中主要存在四種花色苷，分別為矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-蕓香糖苷、矢車菊素-3-槐糖苷和矢車菊素-3-葡萄糖-蕓香糖苷。更準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果還有待于水解色素的進一步分析以及HPLC、質(zhì)譜、核磁共振等手段對色素進行更加深入的研究。

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Purification and identification of pigments in red raspberry

SUN Xi-yun1，LIU Ning2，WU Zhao-xia1，ZHANG Qi1，MENG Xian-jun1，*
（1.Shenyang Agriculture University，College of Food，Shenyang 110161，China；2.Shenyang Agriculture University，College of Land and Environmental Science，Shenyang 110161，China）

Natural pigment was extracted from red raspberry fruit and purified by macroporous resin.Paper chromatography was applied to separate compositions of the pigment.Various compositions were preliminary identified using UV-visible spectroscopy and paper chromatography.The results showed that HPD-700 macroporous resin was more appropriate for purification of the pigments in red raspberry，adsorption rate was better when pH value of extraction solution was 2，elution effect was higher with 60%ethanol as eluent，volume 4BV，velocity of flow 0.6mL/min.Four components were obtained through paper chromatography and initially identified as cyanidin-3-Grape glycosides，cyanidin-3-rutinoside，cyanidin-3-Sophora japonica glycosides and cyanidin-3-glucose rutinoside.

red raspberry；pigment；macroporous resin；ultraviolet spectrum；paper chromatography

TS202.3

A

1002-0306（2011）02-0285-04

樹莓（Raspberry）系薔薇科懸鉤子屬，又稱托盤、馬林、覆盆子等，分布于溫帶和寒帶地區(qū)，歐美各國栽培已有上百年歷史，在我國為近年來新興綠色水果。樹莓果實營養(yǎng)豐富，柔軟多汁，香味獨特，色澤鮮艷，適宜加工成果汁、果醬等多種產(chǎn)品，加工性能極佳。同時樹莓還是優(yōu)秀的提取天然色素的原料，作為紅色果汁天然色素添色劑還有著特殊用途［1］?；ㄉ帐谴嬖谟诠咧械囊活愄烊簧?，許多研究表明它具有較多生理活性功能，包括抗氧化及消除自由基、降低血清及肝臟中的脂肪含量、抗變異及抗腫瘤，防止體內(nèi)過氧化作用等。由于花色苷色素具有較好的著色效果及生理活性功能，故可用于一些高附加值食品的開發(fā)，具有較廣闊的應(yīng)用前景［2］。本文擬對紅樹莓中花色苷色素進行分離及初步鑒定，為進一步明確其生理作用及產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

2010-02-22 *通訊聯(lián)系人

孫希云（1978-），女，講師，在讀博士研究生，主要從事果蔬生物活性成分方面的研究。

國家科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項目（2008GB2B000064）；遼寧省科技廳項目（2008402017）。