楊月琴，彭 敏，胡鳳祖，常小平，馬海樂(lè)，馬世震，*

（1.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，青海西寧810008；2.中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京100049；3.河南科技大學(xué)，河南洛陽(yáng)471003；4.青海省大通寶庫(kù)林場(chǎng)，青海大通810100）

青藏高原藏木香總黃酮提取工藝研究及含量測(cè)定

楊月琴1，2，3，彭 敏1，胡鳳祖1，常小平4，馬海樂(lè)3，馬世震1，*

（1.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，青海西寧810008；2.中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京100049；3.河南科技大學(xué)，河南洛陽(yáng)471003；4.青海省大通寶庫(kù)林場(chǎng)，青海大通810100）

目的：研究藏木香中總黃酮的提取工藝及含量測(cè)定。方法：采用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)選，考察乙醇濃度、溶劑倍數(shù)、提取時(shí)間等因素對(duì)黃酮得率的影響，用紫外分光光度法測(cè)定其含量。結(jié)果：乙醇濃度是主要的影響因素，最佳提取工藝為選用75%乙醇作為提取溶劑，料液比1∶20，水浴熱回流提取2h。以蘆丁為對(duì)照品，采用分光光度法測(cè)定出總黃酮平均含量為0.28mg/g。結(jié)論：提取工藝可行；紫外分光光度法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確；為藏木香深度開(kāi)發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

藏木香，黃酮，提取工藝，紫外分光光度法

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藏木香 青海省大通寶庫(kù)林場(chǎng)藥材人工種植實(shí)驗(yàn)基地栽培，取其根，洗凈，自然陰干，粉碎，備用；蘆丁對(duì)照品 中國(guó)藥品生物制品檢定所；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇 分析純；超純水。

Cary 300紫外掃描分光光度儀 美國(guó) Varin；KQ-100E型超聲波清洗器 昆山科技有限公司；MOLEMENT元素型超純水機(jī) 上海摩勒生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提取工藝 根據(jù)單因素考察結(jié)果、聯(lián)系生產(chǎn)實(shí)際及參考文獻(xiàn)資料，認(rèn)為總黃酮成分的提取與乙醇濃度（因素A）、溶劑倍數(shù)（因素B）及提取時(shí)間（因素C）3個(gè)因素有關(guān)，故選擇其作為考察因素，用L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、優(yōu)選，見(jiàn)表1。

表1 總黃酮提取條件因素水平表

1.2.2 含量測(cè)定方法 采用分光光度法。黃酮類化合物是具有苯并吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)的一類天然化合物的總稱，一般具有4位羰基，且呈現(xiàn)黃色。黃酮類化合物多分布于植物中，大多數(shù)以苷的形式存在。黃酮類化合物中的3-羥基、4-羥基或5-羥基、4-羰基或鄰位酚羥基在亞硝酸鹽存在的堿性條件下與Al（NO3）3形成穩(wěn)定的紅色絡(luò)合物。此絡(luò)合物可不經(jīng)分離用分光光度法直接測(cè)定樣品液中總黃酮的含量。該法中總黃酮的含量的最低檢測(cè)限為3.5!g/mL。

1.2.2.1 對(duì)照品溶液和樣品溶液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品5.0mg，60%乙醇溶解，轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.10mg/mL的對(duì)照品溶液。

稱取干燥的栽培藏木香粉末1.500g，置平底燒瓶中，按照表1正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法加入一定濃度、一定體積的乙醇，在80℃恒溫水浴中回流提取2次，過(guò)濾，合并提取液，濾液減壓回收乙醇至無(wú)乙醇味，再用60%乙醇定容至50mL，搖勻，即為樣品液，備用。

1.2.2.2 分光光度法 精密吸取一定量對(duì)照品和樣品溶液置于50mL容量瓶中，取2.0mL加60%乙醇至6.0mL，加5%NaNO2溶液1.0mL，搖勻，放置6min，加10%Al（NO3）3溶液1.0mL，搖勻，放置6min，加10% NaOH溶液10mL，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)試劑作空白，測(cè)定吸光度。顯色后的對(duì)照品和樣品溶液在400～600nm間掃描，對(duì)照品和樣品溶液均在510nm處有最大吸收。

2 結(jié)果與分析

2.1 含量測(cè)定方法研究結(jié)果

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密量取對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，置于50mL容量瓶中，各取2.0mL以上述

1.2.2.2 方法測(cè)定吸光度（見(jiàn)圖1）。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

以質(zhì)量濃度（X）與吸光度（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=9.53X+0.0462，r=0.9993，結(jié)果表明在此范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一濃度的對(duì)照品溶液5份，各2.0mL依1.2.2.2測(cè)定方法測(cè)定吸光度（見(jiàn)表2）。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）

計(jì)算RSD為1.10%（n=5）。結(jié)果表明，在該條件下精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 對(duì)5份平行制備的藏木香樣品溶液，各取2.0mL依1.2.2.2測(cè)定方法測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮的平均含量為0.2536mg/g，RSD為1.64%。表3表明，該條件下重現(xiàn)性良好。

表3 樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)（n=5）

2.1.4 回收率實(shí)驗(yàn) 稱取同一批藏木香粉末，分別精密加入0.20mg蘆丁對(duì)照品，按樣品溶液制備法制備，并測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）

計(jì)算總黃酮回收率的平均值為99.0%，RSD為1.54%（n=5）。測(cè)定結(jié)果表明，用此方法進(jìn)行青藏高原藏木香總黃酮的測(cè)定，回收率符合要求。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)提取工藝結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表5及表6。

表5的結(jié)果表明，用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)選，得到藏木香總黃酮提取的較優(yōu)水平搭配為A2B3C3；因素主次順序A＞B＞C。即藏木香總黃酮較優(yōu)提取工藝為：選用75%乙醇作為提取溶劑，料液比1∶20，水浴熱回流提取2h。表6方差分析結(jié)果表明，乙醇濃度對(duì)總黃酮含量的影響顯著，F(xiàn)值=26.57143＞F0.05；而溶劑倍數(shù)和提取時(shí)間均對(duì)其無(wú)顯著影響。如從節(jié)約資源及時(shí)間方面考慮，建議在生產(chǎn)實(shí)踐中，將較優(yōu)水平搭配A2B3C3中的B3改為B2，C3改為C1，即用75%乙醇做提取液，料液比1∶15，回流提取1h，重復(fù)2次來(lái)作為藏木香總黃酮類化合物提取的較優(yōu)提取工藝。

表5 藏木香總黃酮正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）

表6 方差分析結(jié)果

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按最佳提取工藝A2B3C3進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)5次，結(jié)果總黃酮含量分別為 0.273、0.282、0.285、0.279、0.281mg/g，平均為0.28mg/g，RSD為1.60%。

3 結(jié)論

3.1 采用分光光度法檢測(cè)藏木香黃酮類化合物，儀器操作簡(jiǎn)單方便，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度Y在2～10μg/mL范圍內(nèi)與吸光度X呈良好的線性關(guān)系（Y=9.53X+ 0.0462，r=0.9993）；精密度良好，RSD為 1.10%（n=5）；重現(xiàn)性良好，RSD為1.64%（n=5）；平均回收率為99.0%。

3.2 用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)選，得到藏木香總黃酮最佳提取工藝為：選用75%乙醇作為提取溶劑，料液比1∶20，水浴熱回流提取2h。乙醇濃度對(duì)總黃酮含量的影響顯著，F(xiàn)值＞F0.05；而溶劑倍數(shù)和提取時(shí)間均對(duì)其無(wú)顯著影響，F(xiàn)值＜F0.05。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到藏木香總黃酮的平均含量為0.28mg/g。在本研究的基礎(chǔ)上，繼續(xù)開(kāi)展對(duì)藏木香黃酮類物質(zhì)的作用機(jī)制、療效等研究，為藏木香功能食品及其他產(chǎn)品研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

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［2］楊永昌，何廷農(nóng)，盧生蓮，等.藏藥志［M］.西寧：青海人民出版社，1991.

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Study on the extraction technique and quantification of total flavonoids in Inula racemosa grown in Qinghai-Tibet plateau

YANG Yue-qin1，2，3，PENG Min1，HU Feng-zu1，CHANG Xiao-ping4，MA Hai-le3，MA Shi-zhen1，*
（1.Northwest Institute of Plateau Biology，Chinese Academy of Sciences，Xining 810008，China；2.Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China；3.Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China；4.Qinghai Baoku Forestry Farm，Datong 810100，China）

Objective：Aim to study the best conditions of extraction techniques for total flavonoids in Inula racemosa. Methods：The best conditions of extraction technique for total flavonoids were optimized with orthogonal experiment.Developed by ethanol solution with different concentrations，solvent multiples and extraction duration，determination of total flavonoids with UV-spectrophotometry was made.Results：Ethanol concentration was the major factor for determining total flavonoids contents.The best conditions for the extraction techniques of total flavonoids were：75%ethanol which was 20 times of the medicine amount，reflux extracting 2 hours.The yield of total flavonoids in Inula racemosa was estimated at 0.28mg/g.Conclusion：The extraction techniques are feasible and the UV-spectrophotometric method is simple，quick and accurate.

Inula racemosa；flavonoids；extraction technique；UV-spectrophotometric method

TS201.2

B

1002-0306（2011）02-0251-03

藏木香（Inula racemosa Hook.f.）為菊科植物，主要分布在青海、甘肅、西藏、四川等省區(qū)海拔2000m以上地區(qū)，氣味芳香濃郁，具有行氣鎮(zhèn)痛、健脾消食、溫中和胃等功效；藏木香既含有藥用成分，又是保健食品敷料和香料的主要成分［1-4］，是一種急需開(kāi)發(fā)利用的資源，其潛在的功能食品開(kāi)發(fā)前景值得我們發(fā)掘和研究。目前僅青海、甘肅和四川省相關(guān)科研與企業(yè)開(kāi)展了藏木香的人工栽培和繁育技術(shù)研究與攻關(guān)，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值及抗病機(jī)理及產(chǎn)品研發(fā)等卻尚未得到深入的研究［4-5］。黃酮類化合物是中草藥的活性成分之一，具有多種醫(yī)療、保健功效，可清除體內(nèi)自由基，延緩衰老和抑制腫瘤，防護(hù)紫外線傷害等，除了具有顯著的藥用價(jià)值外，還可作為食品添加劑直接應(yīng)用在食品中或者作為活性成分開(kāi)發(fā)成為功能性食品。而定性定量檢測(cè)是對(duì)其進(jìn)行分類和質(zhì)量評(píng)價(jià)的前提條件，盡管其他一些現(xiàn)代化的儀器分析方法如毛細(xì)管電泳和微膠束毛細(xì)管色譜也已經(jīng)被應(yīng)用于黃酮類物質(zhì)的檢測(cè)，但目前應(yīng)用最廣泛的還是分光光度法及使用C18柱的HPLC系統(tǒng)［6-12］。青藏高原藏木香的黃酮類化合物尚未被開(kāi)發(fā)利用，本研究首次對(duì)藏木香根中的總黃酮進(jìn)行提取工藝研究及含量測(cè)定，旨在為藏木香保健品的進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)的科學(xué)的理論依據(jù)。

2010-05-20 *通訊聯(lián)系人

楊月琴（1975-），女，碩士，講師，從事功能性食品開(kāi)發(fā)方面的研究。

河南科技大學(xué)特聘教授科研啟動(dòng)費(fèi)（09004004）；青海省重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（2006-034）。