姜曉雷，韓 丹，李明達(dá)，陳 霞，趙 睿，趙長新

（大連工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，遼寧大連116034）

幾種麥芽抗酵母菌粗蛋白含量比較及性質(zhì)分析

姜曉雷，韓 丹，李明達(dá)，陳 霞，趙 睿，趙長新*

（大連工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，遼寧大連116034）

采用硫酸提取及硫酸銨分級(jí)沉淀法對(duì)八種國內(nèi)外麥芽的抗酵母蛋白進(jìn)行了含量分析，得出國產(chǎn)Danpi-2的抗酵母粗蛋白含量最高，達(dá)到338!g/g麥芽；同時(shí)對(duì)抗酵母蛋白的性質(zhì)進(jìn)行了分析，得出分子量為10kDa左右的抗酵母粗蛋白能抵抗100℃的高溫，把抗酵母粗蛋白加入到發(fā)酵液中，酵母數(shù)量大量減少，酵母對(duì)葡萄糖的利用下降，pH下降緩慢，當(dāng)粗蛋白含量達(dá)到32!g/mL時(shí)，酵母生長抑制率達(dá)到了50%。

大麥麥芽，抗酵母蛋白，性質(zhì)分析

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Gardner麥芽、Baudin麥芽、Metcedfe麥芽、Schooner麥芽、Kenpi-8麥芽、Danpi-2麥芽、Kenpi-7麥芽、Ganpi-5麥芽 普蘭店中糧麥芽有限公司提供；酵母接種酵母培養(yǎng)基 1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.5%酵母膏、0.3%大麥汁；考馬斯亮藍(lán)R-250/G-250、硫酸銨、濃硫酸、乙腈、NaOH、葡萄糖、酵母膏、蛋白胨等 均為國產(chǎn)分析純；丙烯酰胺、甘氨酸Amresco；SDS-PAGE低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn) TaKala。

ZPS-250H智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱 黑龍江東拓儀器制造有限公司；WFJ7200可見光分光光度計(jì)尤尼柯儀器有限公司；GTL-16A離心機(jī) 上海浦東物理光學(xué)儀器廠；JM-250型垂直板電泳儀 上海捷邁科貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗菌蛋白的制備［6-7，9］將麥芽粉碎后，取50目粉末與0.05mol/L硫酸以1∶4混合，冰浴浸提3h，中間每隔15min攪拌一次，提取結(jié)束后，在 4℃，8000r/min離心10min，除去沉淀，上清用0.5mol/L氫氧化鈉調(diào)pH為7.0，將上清加入硫酸銨使飽和度達(dá)到30%，放置2h后，在4℃，10000r/min離心10min，除去沉淀，上清液加入硫酸銨至飽和度為80%，在4℃，10000r/min離心10min，除去上清，用少量去離子水復(fù)溶沉淀得抗菌蛋白液，將水復(fù)溶的抗菌蛋白液加入排阻1000Da的透析袋中，用去離子水透析過夜，至無硫酸根離子（用氯化鋇檢測），在 4℃，10000r/min離心10min，去除沉淀，上清液冷凍干燥后加入25%乙腈溶液（即乙腈∶水=1∶4）復(fù)溶，在4℃放置1h后10000r/min離心10min去除沉淀，保留上清液，保留的上清液用0.45!m的硝酸纖維濾膜過濾，即為抗菌蛋白液。實(shí)驗(yàn)組為將抗菌蛋白液加入到酵母培養(yǎng)基中所得吸光值，空白對(duì)照為將25%乙腈溶液（即乙腈∶水=1∶4）加入到酵母培養(yǎng)液中所得吸光值。

1.2.2 抗酵母菌活性測定 對(duì)酵母抗菌活性的測定：將酵母接種于酵母培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)12h，使酵母數(shù)量達(dá)到1.25×107個(gè)/mL。按5%接種量接種至新的酵母培養(yǎng)基中，使酵母數(shù)量達(dá)到6×105個(gè)/mL，加入提取的蛋白液1mL，使蛋白達(dá)到一定的含量，培養(yǎng)24h，在600nm下測定吸光值。

抑菌率按如下公式計(jì)算：抑菌率（%）=（D-S）/ D×100%，式中，D為空白在600nm吸光值，S為實(shí)驗(yàn)組樣在600nm吸光值。

1.3 抗菌蛋白含量測定

考馬斯亮藍(lán)法測蛋白質(zhì)含量，詳見參考文獻(xiàn)［10］。

1.4 SDS-PAGE電泳

將麥芽用0.05mol/L硫酸浸提，采用硫酸銨分級(jí)沉淀，透析后的上清液用于電泳分析。電泳技術(shù)采用不連續(xù)電泳方法，分離膠為5%，濃縮膠為12%，操作過程詳見參考文獻(xiàn)［11］。

1.5 抗酵母粗蛋白耐熱性分析

將用0.05mol/L硫酸浸提，采用硫酸銨分級(jí)沉淀，透析后的上清液于100℃水浴放置20min，做SDS-PAGE電泳分析，電泳方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 八種麥芽的抗酵母粗蛋白含量分析

由圖1顯示不同品種麥芽間的抗酵母粗蛋白含量差異較大。國產(chǎn)Danpi-2的抗酵母粗蛋白含量最高，達(dá)到338!g/g；其次是加麥Metcedfe、Schooner和國產(chǎn)Ganpi-5，含量為322、310、312!g/g；國產(chǎn)Kenpi -8、Kenpi-7和澳麥Gardner、Baudin含量比較低，分別為234、269、263、271!g/g。以下抗菌活性實(shí)驗(yàn)麥芽都以國產(chǎn)Danpi-2為實(shí)驗(yàn)原料。

圖1 八種麥芽抗酵母粗蛋白含量比較

圖2是八種大麥的粗蛋白電泳圖，顯示不同品種間的抗酵母粗蛋白含量大體相同，蛋白條帶位置基本相同，蛋白分子量分別為40、20、10kDa左右。由于用0.05mol/L硫酸作為浸提液，有效地分解了雜蛋白，而保留了一些結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、耐酸分解的蛋白，提高了抗酵母粗蛋白的提取率［10］。

圖2 八種麥芽的粗蛋白SDS-PAGE電泳分析

2.2 抗酵母粗蛋白耐熱性分析

如圖3所示，經(jīng)100℃煮沸20min后，與圖2相比，三條蛋白泳道減少了一條分子量大概為20kDa的泳道，減少的這條蛋白為TLP［7］蛋白，而保留了分子量40kDa的蛋白（泡沫蛋白Z）［7-8］，由于一些蛋白受熱變性，導(dǎo)致條帶變細(xì)。分子量10kDa的小分子蛋白為LTP蛋白［8-9］，還有一些分子量更小的如硫堇（分子量5kDa左右）、植物防衛(wèi)素（分子量5kDa）［9］，電泳沒有顯示出來，它們也能抵抗100℃的高溫而不變性。

圖3 煮沸20min后的麥芽SDS-PAGE電泳圖

2.3 抗酵母粗蛋白的抗菌活性分析

2.3.1 抗酵母粗蛋白對(duì)酵母生長及葡萄糖代謝的影響 提取國產(chǎn)Danpi-2的抗酵母粗蛋白加入培養(yǎng)基中，如圖4所示。當(dāng)培養(yǎng)基中粗蛋白達(dá)到32!g/mL時(shí)，酵母生長明顯受到抑制，當(dāng)培養(yǎng)12h后，抑制率達(dá)到了50%左右，而對(duì)照組在0～8h時(shí)處于迅速增長期，加入抗酵母粗蛋白的酵母培養(yǎng)基，酵母在0～18h時(shí)處于對(duì)數(shù)期，增長緩慢。這說明抗酵母粗蛋白的加入，使得細(xì)胞受到攻擊而發(fā)生變化，影響細(xì)胞的增殖，延長細(xì)胞的對(duì)數(shù)期且延緩對(duì)數(shù)期細(xì)胞的增殖。

圖4 抗酵母粗蛋白對(duì)酵母生長的影響

圖5顯示了酵母生長過程中葡萄糖含量的變化。對(duì)照組的糖消耗速率隨時(shí)間變化迅速下降，到12h時(shí)發(fā)酵液中的糖已耗完，而添加32!g/mL抗酵母粗蛋白的酵母培養(yǎng)基中葡萄糖消耗緩慢，一直到24h也沒有消耗完。

圖5 抗酵母蛋白對(duì)糖代謝的影響

2.3.2 抗酵母粗蛋白對(duì)發(fā)酵液中pH的影響 圖6顯示了發(fā)酵液中pH隨時(shí)間的變化，在對(duì)照組中的pH在0～8h下降迅速，從6下降到2.66；而加入抗酵母粗蛋白的實(shí)驗(yàn)組pH則下降緩慢，0～8h pH從6下降到4.52。8h后，溶液的pH變化減慢，對(duì)照組的pH基本不變，到24h發(fā)酵結(jié)束時(shí)pH為2.13，實(shí)驗(yàn)組到24h發(fā)酵結(jié)束時(shí)pH為3.1。

圖6 抗酵母活性蛋白對(duì)發(fā)酵液中pH的變化

2.3.3 不同濃度的抗酵母粗蛋白對(duì)酵母生長抑制率的影響 由圖7可看出不同濃度的粗蛋白對(duì)酵母生長的影響，隨著加入的粗蛋白含量的增加，酵母的生長抑制率也在增加，當(dāng)抗酵母蛋白含量在32!g/mL時(shí)，酵母生長抑制率達(dá)到了50%，當(dāng)?shù)鞍缀繛?0!g/mL時(shí)，酵母生長抑制率達(dá)到了70%。

3 結(jié)論

本文對(duì)八種國內(nèi)外麥芽的抗酵母蛋白進(jìn)行了含量分析，得出國產(chǎn)Danpi-2的抗酵母粗蛋白含量最高，達(dá)到338!g/g，其次是加麥Metcedfe，為322!g/g；同時(shí)對(duì)抗酵母蛋白的性質(zhì)進(jìn)行了分析，得出分子量為10kDa左右的抗酵母粗蛋白能抵抗100℃的高溫，加入抗酵母粗蛋白的發(fā)酵液中酵母數(shù)量大量減少，酵母對(duì)葡萄糖的利用下降，pH下降緩慢，當(dāng)粗蛋白含量達(dá)到 32!g/mL時(shí)，酵母生長抑制率達(dá)到了50%。

圖7 不同含量的抗酵母粗蛋白對(duì)培養(yǎng)12h后酵母生長抑制率影響

啤酒發(fā)酵過程中經(jīng)常出現(xiàn)的酵母耗糖速度過慢的問題是長期以來困擾啤酒生產(chǎn)企業(yè)的主要技術(shù)問題之一，其直接導(dǎo)致啤酒發(fā)酵周期延長、產(chǎn)量下降，從而增加了啤酒的生產(chǎn)成本。啤酒酵母和麥芽是啤酒生產(chǎn)的兩個(gè)關(guān)鍵因素，其質(zhì)量的優(yōu)劣直接決定著啤酒的風(fēng)味和成本，很長時(shí)間里人們把酵母耗糖速度過慢的問題歸結(jié)于啤酒酵母的質(zhì)量，認(rèn)為是酵母的添加量不足，使用代數(shù)過多或者麥汁充氧不足導(dǎo)致酵母活力下降，于是人們通過對(duì)現(xiàn)有生產(chǎn)菌種進(jìn)行改造或篩選新的耗糖速度較快的酵母菌種，或者減少酵母的使用代數(shù)的方法試圖解決上述問題，但是效果并不是很理想。然而隨著啤酒發(fā)酵理論和制麥理論的發(fā)展，研究者將解決上述問題的注意力逐漸的轉(zhuǎn)移到啤酒的原料——麥芽上，其中抗酵母多肽（簡稱抗菌肽）的發(fā)現(xiàn)標(biāo)志著向從根本上解決此技術(shù)難題邁出了堅(jiān)實(shí)的一步［12-13］。

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Character analysis and content comparison of anti-yeast crude protein from several kinds of barley malt

JIANG Xiao-lei，HAN Dan，LI Ming-da，CHEN Xia，ZHAO Rui，ZHAO Chang-xin*
（College of Bio.&Food Tech.，Dalian Institute of Light Industry，Dalian 116034，China）

Out of the eight malt types tested，Danpi-2 barley showed the highest concentration of toxic crude protein with 338!g/g of crude protein，which extracted from malt by sulphuric acid and fractionated by ammonium sulphate precipitation.The character analysis of anti-yeast protein also showed that 10kDa protein tolered temperature as high as 100℃.Adding anti-yeast crude protein into fermentation liquor，the yeast amount decreased remarkably，utilization of glucose decreased and pH decreased slowly.When the concentration of proteins was increased to 32!g/mL，the inhibition ratio also went up by 50%.

barley malt；anti-yeast protein；character analysis

TS210.1

A

1002-0306（2011）02-0112-04

大麥在自然界的生長過程中，不可避免的要遭受自然界中一種或多種病原微生物的侵害，為了抵御這種侵害，大麥自身逐漸形成了各種各樣的防御機(jī)制［1-2］。一些植物通過分泌一些化學(xué)物質(zhì)來殺滅或抑制某種病原真菌的侵染或生長，有些產(chǎn)生一系列的抗菌蛋白或抗菌多肽，這些抗菌多肽或抗菌蛋白具有廣譜抗菌性，到目前為止，一些類型的抗菌蛋白和抗菌肽已經(jīng)被分離出來，并且有些結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)研究得比較清楚，如植物或昆蟲、哺乳動(dòng)物防御素、硫堇、橡膠素、類打結(jié)素、脂轉(zhuǎn)移蛋白類等［3-5］。1970年，Okada［6］等人從大麥和小麥中分離出了一種抗菌蛋白，分子量在9kDa左右，這種蛋白具有廣譜抗菌性，能耐受100℃的高溫；2004年和2005年，Gorjanovic'，S.［7-8］等人從大麥中分離出來一種分子量在16kDa的蛋白，并指出是一種脂轉(zhuǎn)移蛋白。2008年，Sandra N.E.［9］等人從大麥中粗提出一類具有抗菌作用的多組分蛋白，里面含有Ns-LTP、硫堇、植物防衛(wèi)素等，具有強(qiáng)烈的抗酵母活性。本文針對(duì)國內(nèi)外幾種麥芽進(jìn)行抗酵母粗蛋白的提取，研究不同品種麥芽的抗酵母粗蛋白含量差別，其對(duì)酵母菌生長、糖代謝、pH變化等的影響，為發(fā)酵工業(yè)尤其是啤酒生產(chǎn)中出現(xiàn)的問題提供理論支持。

2010-02-08 *通訊聯(lián)系人

姜曉雷（1983-），男，在讀碩士研究生，研究方向：國產(chǎn)大麥蛋白分離和制麥工藝。

國家“十一五”國家科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2007BAK36B01）。