李 雪，尤 娟，羅永康

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

草魚肉蛋白酶解物功能特性及質(zhì)量控制的研究

李 雪，尤 娟，羅永康*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

采用Neutrase對(duì)草魚魚肉蛋白進(jìn)行了酶解，得到了水解度（DH）為4.72%、9.80%、13.32%的酶解產(chǎn)物（NH），并分析了pH與水解度對(duì)酶解產(chǎn)物功能特性的影響。結(jié)果表明，酶解產(chǎn)物的溶解性、乳化性、起泡性在pH為4時(shí)達(dá)到最低，而后隨pH的增大而增加。在pH為3～8的范圍內(nèi)隨水解度的增加，酶解產(chǎn)物的溶解性增加，起泡性降低。pH為4時(shí)，水解度為4.72%、9.80%、13.32%的酶解產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性之間存在顯著性差異（P＜0.05），且隨水解度升高而增大。在pH為3～5的范圍內(nèi)酶解產(chǎn)物的乳化性隨水解度升高而降低。酶解產(chǎn)物的溶解性、乳化性、起泡性間存在相關(guān)性（P＜0.05）。

草魚，水解，功能特性

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

草魚 購于北京健翔橋農(nóng)貿(mào)市場，活體運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，去鱗、去內(nèi)臟、去頭、去骨、洗凈后進(jìn)行采肉（取白肉），用攪碎機(jī)攪成肉糜；三硝基苯磺酸（TNBS） 美國Sigma公司；Neutrase 丹麥NOVO公司；魯花牌5S壓榨花生油 市售；其他所用試劑 均為化學(xué)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 草魚魚肉蛋白水解產(chǎn)物的制備工藝 草魚肉糜→與水混合→滅內(nèi)源性酶（90℃、15min）→均質(zhì)→調(diào)溫度、pH→加中性蛋白酶酶解→滅酶（90℃、10min）→離心（3600r/min、20min）→取上清液→冷凍干燥→草魚魚肉蛋白水解產(chǎn)物

1.2.2 水解產(chǎn)物成分的測定 蛋白質(zhì)含量的測定：凱氏定氮法［7］；脂肪含量的測定：索氏抽提法（GB5497-85）；水分含量的測定：105℃恒重法（GB5512-85）；灰分含量的測定：550℃灼燒法（GB5505-85）。

1.2.3 水解度的測定 采用三硝基苯磺酸法（Trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）［8-9］：將樣品用1%十二烷基硫酸鈉（SDS）稀釋至一定濃度（1L樣品中含有的氨基當(dāng)量為0.25×10-3～2.5×10-3）。取0.25mL的樣品混合2.00mL pH8.2磷酸緩沖溶液和2.00mL 0.1%TNBS溶液，于50℃暗室中反應(yīng)60min。反應(yīng)完畢之后，立即用4.00mL 0.1mol/L HCl終止反應(yīng)，接著在室溫下放置30min，于420nm下測其吸光值，在0～2.5×10-3mol/L L-亮氨酸的范圍內(nèi)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。水解度的計(jì)算公式如下：

式中，AN1：未水解樣品中每克蛋白含有的氨基當(dāng)量（mmol/g蛋白）；F1：未水解樣品的稀釋倍數(shù)；AN2：水解樣品中每克蛋白含有的氨基當(dāng)量（mmol/g蛋白）；F2：水解樣品的稀釋倍數(shù)；htot：每克原料蛋白質(zhì)的總的肽鍵毫摩爾數(shù)，本研究采用魚肉為原料取htot=8.6。

1.2.4 功能特性的測定

隴西縣是甘肅省43個(gè)國家級(jí)貧困縣之一，全省58個(gè)扶貧重點(diǎn)縣之一，整體屬于六盤山等14個(gè)連片扶貧開發(fā)區(qū)域，2017年全省減少貧困人口67萬人，貧困發(fā)生率由14.2%下降到9.6%，2017年隴西縣貧困發(fā)生率依然是12.4%（回退前），貧困面還很大。如何繼續(xù)深入實(shí)施東西部扶貧協(xié)作，精準(zhǔn)扶貧、精準(zhǔn)脫貧，實(shí)現(xiàn)到2020年現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)下農(nóng)村貧困人口實(shí)現(xiàn)脫貧，解決區(qū)域性整體貧困意義重大。

1.2.4.1 溶解性的測定 稱取0.01g水解產(chǎn)物，用去離子水配制成10mL溶液，用濃度為1mol/L HCl或NaOH將溶液 pH調(diào)節(jié)到 3、4、5、6、7、8，然后在10000r/min離心15min，上清液中的蛋白質(zhì)含量采用雙縮脲法進(jìn)行測定［10］。樣品中總蛋白含量采用凱氏定氮法［7］測定。溶解性的計(jì)算公式如下：

1.2.4.2 熱穩(wěn)定性的測定 稱取0.01g水解產(chǎn)物，用去離子水配制成10mL溶液，用濃度為1mol/L HCl或NaOH將溶液pH調(diào)節(jié)到4、7、8，然后在水浴鍋中進(jìn)行熱處理（63℃、30min或93℃、30s），熱處理后立即放入0℃冰水混合物中冷卻10min，于10000r/min下離心15min。蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性以熱處理后的溶解性表示。

1.2.4.3 乳化性的測定［11］取1%的水解產(chǎn)物溶液3.0mL，邊攪拌邊加入花生油1.0mL，然后以10000r/min的速度高速勻漿1min制成乳濁液，用微量注射器從下部抽取0.1mL，加入9.9mL 0.1%的十二烷基磺酸鈉（SDS）溶液制成混合液，在500nm的波長下測吸光度A0。乳化活性指數(shù)（EAI）計(jì)算公式如下：

式中，T=2.303；A0為乳化完成后立即測定的吸光度；W為蛋白質(zhì)含量（g，乳化前水解產(chǎn)物的濃度）。

1.2.4.4 起泡性的測定［12］取20mL濃度為0.5%蛋白溶液，分別將其pH調(diào)至3、4、5、6、7、8，在均質(zhì)機(jī)中以23000r/min轉(zhuǎn)速攪拌1.5min，隨后立即轉(zhuǎn)入50mL的測量筒內(nèi)測量攪拌后的體積。起泡性的計(jì)算公式如下：

式中，A為攪拌后的體積（mL）；B為攪拌前的體積（mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚肉水解產(chǎn)物的化學(xué)組成

草魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物的化學(xué)組成如表1所示。

表1 草魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物的成分組成

2.2 水解度

采用TNBS法測定草魚魚肉蛋白的水解度，其水解度隨時(shí)間的變化如圖1所示。由圖1可知，在最初的30min內(nèi)，水解速率較高，隨后水解速率逐漸降低。這與其他有關(guān)魚肉蛋白水解的研究報(bào)道中水解速率的變化趨勢相一致［13］。這一趨勢表明在最初的30min內(nèi)，中性蛋白酶對(duì)草魚魚肉蛋白的水解作用最強(qiáng)，隨后水解體系中游離氨基酸含量增多，中性蛋白酶的水解作用逐漸受到抑制，水解速率減慢。

圖1 草魚肉蛋白酶解的水解度隨時(shí)間的變化

2.3 水解產(chǎn)物的功能特性

2.3.1 溶解性 pH及水解度對(duì)蛋白酶解產(chǎn)物溶解性的影響在國內(nèi)外研究中都有報(bào)道，對(duì)黃色條紋鲹、沙丁魚副產(chǎn)物、鰱魚肉等酶解產(chǎn)物的研究［1，13-14］表明，酶解可以有效改善原料蛋白的溶解性，酶解產(chǎn)物在不同的pH下均具有良好的溶解性，并且隨著水解度的增加，酶解產(chǎn)物的溶解性增大，pH對(duì)酶解產(chǎn)物溶解性影響變小。對(duì)草魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物溶解特性的研究也得到了與上述報(bào)道相似的結(jié)論。

不同水解度草魚魚肉蛋白水解產(chǎn)物的溶解性能如圖2所示。從圖2可以看出，草魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物在pH為3～8的范圍內(nèi)均具有較好的溶解性，溶解性大于82%。在pH為4時(shí)不同水解度酶解產(chǎn)物的溶解性均達(dá)到最低，而后隨 pH增加而增大。Quaglia［14］等在研究中指出，pH會(huì)影響酶解產(chǎn)物肽段的靜電荷數(shù)量，從而導(dǎo)致溶解性發(fā)生變化。在相同pH下水解度較高的酶解產(chǎn)物溶解性較好。Shahidi［15］等在研究中指出，隨著水解度的增加，水解體系中小肽的含量增多，原料蛋白中越多的極性基團(tuán)被暴露，水解產(chǎn)物的親水性增加，因此水解產(chǎn)物溶解性增加。

圖2 溶液pH對(duì)草魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物溶解性的影響注：相同字母表示同一pH下中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的

溶解性之間差異不顯著，P＞0.05。

2.3.2 熱穩(wěn)定性 以蛋白水解產(chǎn)物為基料或食品添加劑的食品在其加工過程經(jīng)常要經(jīng)過高溫處理，蛋白質(zhì)在加熱過程中分子間的各種作用力被破壞，蛋白質(zhì)分子構(gòu)象發(fā)生變化，疏水基團(tuán)暴露，進(jìn)而發(fā)生凝集，溶解性下降。因此水解產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性是衡量其是否適于在食品中應(yīng)用的一個(gè)重要指標(biāo)。

蛋白質(zhì)分子經(jīng)水解后肽鏈展開，親水-疏水平衡得到改善，更易與水分子形成氫鍵，因此水解產(chǎn)物經(jīng)熱處理后不易發(fā)生分子間的凝集，溶解性可保持在較高水平。由圖3、圖4可知，在pH為4時(shí)，隨著水解度的增加，酶解產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性增加（P＜0.05），pH為7、8時(shí)，不同水解度酶解產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性差異不顯著（P＞0.05）。除DH=4.72%的水解物外，其它兩水解度的水解產(chǎn)物經(jīng)63℃、30min，93℃、30s熱處理后均具較好的熱穩(wěn)定性，溶解性保持在82%以上。趙玉紅［16］對(duì)鰱魚下腳料進(jìn)行酶解，所得酶解產(chǎn)物也具有較好的熱穩(wěn)定性。

圖3 63℃、30min熱處理?xiàng)l件下草魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性

2.3.3 乳化性 乳化活性指數(shù)是衡量蛋白質(zhì)乳化性的常用指標(biāo)。草魚魚肉蛋白中性蛋白酶酶解產(chǎn)物在水解度為4.72%、9.80%、13.32%時(shí)的乳化性如圖5所示。水解產(chǎn)物的乳化性在pH為4時(shí)達(dá)到最低，而后隨著pH的增加而增大。在pH為3～5的范圍內(nèi)酶解產(chǎn)物的乳化性隨水解度的升高而降低。

圖4 93℃、30s熱處理?xiàng)l件下草魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性

圖5 pH對(duì)草魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物乳化活性指數(shù)的影響注：相同字母表示同一pH下中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的乳化活性指數(shù)之間差異不顯著，P＞0.05。

酶解對(duì)水解產(chǎn)物乳化性的影響已有一些報(bào)道。蛋白質(zhì)被水解后，分子內(nèi)部的疏水殘基暴露，蛋白質(zhì)在油-水界面吸附、擴(kuò)散能力提高，乳化能力增強(qiáng)。Rahali［17］在研究中指出，肽段的長度和兩親性是影響酶解產(chǎn)物乳化性的重要因素。Klompong［1］等在有關(guān)水解度對(duì)酶解產(chǎn)物乳化性影響的研究中指出，較高的水解度會(huì)導(dǎo)致水解產(chǎn)物中小分子的肽和游離氨基酸含量增多，使蛋白質(zhì)在油-水界面吸附、擴(kuò)散的能力下降，導(dǎo)致乳化性有所下降。

2.3.4 起泡性 由圖6可知，中性蛋白酶不同水解度酶解產(chǎn)物的起泡性均在pH為4時(shí)達(dá)到最低，而后隨著pH的增加起泡性增強(qiáng)。與本研究相似，Klompong［1］以黃條紋鲹為原料、董士遠(yuǎn)［13］以鰱魚魚肉為原料、Qian［18］以豬血漿蛋白為原料所得的酶解產(chǎn)物在溶解性最低的pH下起泡性也達(dá)最低。Qian［18］等在研究中指出，酶解產(chǎn)物的溶解性較差時(shí)，蛋白質(zhì)無法迅速地轉(zhuǎn)移到分界面，導(dǎo)致酶解產(chǎn)物的起泡性也較弱。本研究與 Klompong［1］、董士遠(yuǎn)［13］、Qian［19］等對(duì)酶解產(chǎn)物起泡特性的研究報(bào)道基本相似，在相同pH下，隨水解度的增加酶解產(chǎn)物的起泡性降低。這可能是因?yàn)殡S著水解度增加，蛋白質(zhì)分子的肽段變短、分子量下降，其在界面上的展開和重排受到影響，起泡性降低。

3 結(jié)論

3.1 Neutrase酶解草魚魚肉蛋白產(chǎn)物在pH為3～8的范圍內(nèi)溶解性均大于82%，在pH為4時(shí)除DH= 4.72%的酶解產(chǎn)物外，其他兩水解度的酶解產(chǎn)物經(jīng)63℃、30min，93℃、30s熱處理后均具有較好的熱穩(wěn)定性。

3.2 在pH為3～8的范圍內(nèi)酶解產(chǎn)物的溶解性、乳化性、起泡性隨pH的變化趨勢一致：在pH為4時(shí)達(dá)到最低，而后隨pH的增加而增大。并且在pH為3～8范圍內(nèi)酶解產(chǎn)物的溶解性、乳化性、起泡性間存在相關(guān)性（P＜0.05）。

圖6 pH對(duì)草魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物起泡性的影響注：相同字母表示同一pH下中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的起泡性之間差異不顯著，P＞0.05。

3.3 采用中性蛋白酶酶解改性的草魚魚肉蛋白功能特性良好，可作為食品基料或蛋白強(qiáng)化劑應(yīng)用于食品工業(yè)中。

［1］Klompong V，Benjakul S，Kantachote D，et al.Antioxidative activity and functional properties of protein hydrolysate of yellow stripe Trevally（Selaroides leptolepis）as influenced by the degree of hydrolysis and enzyme type［J］.Food Chemistry，2007，102（4）：1317-1327.

［2］Wasswa J，Tang J，Gu X H，et al.Influence of the extent of enzymatic hydrolysis on the functional properties of protein hydrolysate from grass carp（Ctenopharyngodon idella）skin［J］. Food Chemistry，2007，104：1698-1704.

［3］李娜，趙謀明，任嬌艷.鳙魚酶解可溶性蛋白營養(yǎng)特性及品質(zhì)的研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2009，25（5）：496-473.

［4］閻欲曉.羅非魚活性肽分離及抗氧化能力研究［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2009，28（5）：276-279.

［5］Wang L Z，Yang B，Du X Q.Extraction of acid-soluble collagen from grass carp（Ctenopharyngodon idella）skin［J］. Food Process Engineering，2009，32（5）：743-751.

［6］Wasswa J，Tang W，Gu X H.Functional properties of grass carp（Ctenopharyngodon idella），Nile perch（Lates niloticus） and Nile tilapia（Oreochromis niloticus）skin hydrolysates［J］. Food Properties，2008，11（2）：339-350.

［7］范天吉.乳和乳制品分析檢測與執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)實(shí)務(wù)全書［M］.呼和浩特：內(nèi)蒙古人民出版社，2003：209-227.

［8］Alder-Nissen.Determination of the degrees of hydrolysis of food protein hydrolysates by trinitribenzenesulfonic acid［J］. Agricultural and Food Chemistry，1979，27（6）：1256-1263.

［9］Spellman D，McEovy E，Cuinn G O，et al.Proteinase and exopeptidase hydrolysis of whey protein：comparison of the TNBS，OPA and pH stat methods for quantification of degree of hydrolysis［J］.International Dairy，2003，13：447-453.

［10］楊建雄.生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教程［M］.北京：科學(xué)出版社，2002：33-34.

［11］Pearce K N，Kinsella J E.Emulsifying properties of proteins：evaluation of a turbidimetric technique［J］.Agricultural and Food Chemistry，1978，26：716-723.

［12］Sathe S K，Salunkhe D K.Functional properties of the great northern bean（PhaseolusvulgarisL.）proteins：emulsion，foaming，viscosity and gelation pmpenies［J］.Food Science，1981，46：71-81.

［13］董士遠(yuǎn)，汪東風(fēng).兩種酶水解鰱魚蛋白水解產(chǎn)物的研究［J］.食品科學(xué)，2008，29（12）：94-100.

［14］Quaglia G B，Orban E.Influence of the degree of hydrolysis on the solubility of the protein hydrolysatis from Sardine［J］. Science of Food&Agriculture，1987，38：271-2761.

［15］ShahidiF，HanX Q，SynowieckiJ.Productionand characteristics of protein hydrolysates from capelin（Mallotus villosus）［J］.Food Chemistry，1995，53：285-293.

［16］趙玉紅.魚蛋白水解物功能特性的研究［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，32（2）：105-110.

［17］Rahali V，Chobert J M，Hatertle T，et al.Emusification of chemical and enzymatic hydrolysates of lactogobulin：characterization of the peptids adsorbed at the interface［J］. Nahrung，1997，44：89-95.

［18］Liu Q，Kong BH，Xiong Y L，et al.Antioxidant activity and functional properties of porcine plasma protein hydrolysate as influenced by the degree of hydrolysis［J］.Food Chemistry，2010， 118：403-410.

Functional properties and quality control of protein hydrolysates from grass carp fish（Ctenopharyngodon idellus）meat

LI Xue，YOU Juan，LUO Yong-kang*
（College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

Functional properties of protein hydrolysates from grass carp fish（Ctenopharyngodon idellus）meat，

hydrolyzed by Neutrase（NH）at 4.72%，9.80%and 13.32%of degree of hydrolysis（DH）were investigated.The solubilities，emulsion activity index and foaming capacity were the lowest at pH4.With the DH rising，the solubilities of hydrolysates increased，but the foaming capacity decreased in the pH range of 3～8.The NH displayed a lower heat stability with the DH rising at pH4（P＜0.05）.As the DH rise，the emulsion activity index decreased in the pH range of 3～5.And there were significant relationship between solubility，emulsion activity index and foaming capacity（P＜0.05）.

grass carp；hydrolysis；functional properties

TS254.1

A

1002-0306（2011）02-0081-04

我國淡水魚資源豐富，產(chǎn)量位居世界第一，但我國淡水魚的加工利用率卻不足10%。近些年來國內(nèi)外已有一些采用酶解的方法對(duì)魚蛋白進(jìn)行深加工利用的研究報(bào)道［1-4］。酶解后的魚蛋白產(chǎn)物是多肽、小肽和氨基酸組成的復(fù)雜體系，其與原料蛋白具有相同的氨基酸構(gòu)成，而功能特性及生物活性與原料蛋白相比卻得到了一定的改善。酶解產(chǎn)物的功能特性受原料蛋白理化特性、水解度、所選用酶種類等的影響。因此開展魚蛋白酶解產(chǎn)物功能特性的研究對(duì)淡水魚的深度開發(fā)及魚肉蛋白酶解產(chǎn)物在食品中的應(yīng)用具有重要意義。草魚（Ctenopharyngodon idellus），俗名鯇魚，蛋白質(zhì)含量為15%～20%，是我國第一大淡水魚。目前國外對(duì)于草魚開發(fā)利用的研究報(bào)道較少［2，5-6］，國內(nèi)對(duì)于草魚開發(fā)利用的報(bào)道側(cè)重于草魚酶解工藝、膠原蛋白提取工藝等的研究，未見對(duì)草魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物功能特性進(jìn)行系統(tǒng)研究的報(bào)道。本研究采用中性蛋白酶提取草魚魚肉蛋白水解物，并對(duì)其溶解性、熱穩(wěn)定性、乳化性、起泡性進(jìn)行系統(tǒng)的研究，分析溶解性、乳化性、起泡性間的相關(guān)性，為擴(kuò)大草魚魚肉蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

2010-03-25 *通訊聯(lián)系人

李雪（1987-），女，碩士研究生，主要從事畜水產(chǎn)食品加工研究。

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助（nycytx-49-24）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30871946）；國家科技支撐計(jì)劃（2008BAD94B06）。