河南質(zhì)量工程職業(yè)學(xué)院 王振麗 王婷婷 馬振興 李書華

β-葡萄糖苷酶的提取及轉(zhuǎn)化大豆異黃酮的實(shí)驗(yàn)研究

河南質(zhì)量工程職業(yè)學(xué)院 王振麗 王婷婷 馬振興 李書華

大豆異黃酮（soybean insof avones，簡稱ISO）是一類存在于大豆中的具有重要生物活性的物質(zhì)。它主要分為游離型苷元和結(jié)合型糖苷兩大類，其生物活性主要表現(xiàn)為游離型苷元的生物活性。但是大豆異黃酮主要以結(jié)合型的糖苷（glucosides）形式存在，從大豆中提取的大豆異黃酮中游離型的苷元只占總量的2%～3%，結(jié)合型的糖苷占總量的97%～98%。研究發(fā)現(xiàn)，只有大豆異黃酮糖苷被水解脫去糖基轉(zhuǎn)化成游離型的苷元才能被動物體吸收。目前，大都通過酸解法將結(jié)合型的糖苷降解成游離型的苷元，以提高大豆異黃酮中大豆苷元、染料木素的含量。這些方法工藝復(fù)雜、成本高、有機(jī)溶劑殘留量高，未能得到大規(guī)模的應(yīng)用。本文，筆者利用微生物法進(jìn)行大豆異黃酮的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，取得了良好效果。

一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1.實(shí)驗(yàn)材料。經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的固體培養(yǎng)基。

2.主要試劑及儀器。實(shí)驗(yàn)試劑主要有色譜甲醇、無水乙醇、冰乙酸、磷酸等；實(shí)驗(yàn)儀器主要有低溫離心機(jī)、高效液相色譜儀等。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.β–葡萄糖苷酶酶液的浸提。采用固體發(fā)酵法將培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后，置于研缽中磨至小碎片，分別研究不同提取溶劑、浸提溫度和浸提時間對β–葡萄糖苷酶活力的影響。

2.β–葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)化。準(zhǔn)確稱取1.0 g 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的大豆異黃酮2份，分別置于1號和2號瓶中，1號瓶中加入適量蒸餾水作為對照，2號瓶中加入適量的發(fā)酵粗酶液，于55 ℃水浴鍋中振蕩水解7 h，然后將反應(yīng)液置于4 ℃、5 000 r/min的離心機(jī)中離心15 min，沉淀干燥后用無水乙醇溶解，再用0.45μm濾膜過濾，取樣品10μL。以甲醇∶水∶冰乙酸=42∶57∶1（體積比）為流動相進(jìn)行樣品分析。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

1. 提取溶劑對酶活力的影響。當(dāng)以檸檬酸緩沖液及蒸餾水作為浸提劑時，酶活力較高；其值相差不大?？紤]到成本及操作方便的問題，該實(shí)驗(yàn)以蒸餾水作為提取溶劑。不同提取溶劑對酶活力的影響結(jié)果見表1。

表1 不同提取溶劑對酶活力的影響

2. 不同提取溫度對酶活力的影響。當(dāng)溫度為50℃時，酶活力最高，隨后隨著溫度的升高，酶活力逐漸下降，確定最佳提取溫度為50℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同提取溫度對酶活力的影響

3.不同浸提時間對酶活力的影響。隨著浸泡提取時間的延長，酶活力逐漸升高。當(dāng)浸泡3 h時，β–葡萄糖苷酶活力達(dá)到最高。隨后隨著浸泡時間的延長，酶活力逐漸下降。因此確定其最佳浸提時間為3 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同浸提時間對酶活力的影響

4.酶解前后大豆異黃酮的色譜圖。酶解前大豆異黃酮的色譜如圖3所示，酶解后的色譜如圖4所示。

圖3 酶解前大豆異黃酮的色譜

圖4 酶解后大豆異黃酮的色譜

由圖3、圖4可知，β–葡萄糖苷酶在最佳酶解條件下酶解10%大豆異黃酮，酶解后結(jié)合型的大豆異黃酮含量明顯降低，游離型的大豆異黃酮含量明顯升高。由此可知，酶解后游離型的苷元含量顯著增加，提高了大豆異黃酮的利用率。

三、結(jié)論

1. 通過實(shí)驗(yàn)可知，β–葡萄糖苷酶酶液的最佳浸提條件為：以蒸餾水為浸提溶劑，浸提溫度為50 ℃，時間為3 h。

2. 在一定條件下，大豆異黃酮在β–葡萄糖苷酶作用下，大豆異黃酮苷元的含量明顯增加。由于大豆異黃酮苷元有利于動物體的吸收和利用，可提高其利用率。因此，用β–葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化結(jié)合型大豆異黃酮有廣闊的應(yīng)用前景。