查玉兵，楊春亮*，林 玲，李 濤，程盛華

(中國熱帶農業(yè)科學院農產品加工研究所， 廣東 湛江 524001)

超高效液相色譜-質譜法測定水產品中敵百蟲的含量

查玉兵，楊春亮*，林 玲，李 濤，程盛華

(中國熱帶農業(yè)科學院農產品加工研究所， 廣東 湛江 524001)

建立敵百蟲在水產品中殘留量的超高效液相色譜-電噴霧質譜(UPLC-MS/MS)測定方法。用乙酸乙酯提取樣品中的敵百蟲，提取液經酸性氧化鋁柱凈化，經超高效液相色譜分離，用串聯(lián)質譜測定，正離子多反應監(jiān)測(MRM)模式檢測，外標法定量。在0.02～0.8ng/mL范圍內，敵百蟲標準工作溶液的色譜峰面積與質量濃度成良好的線性關系，相關系數(shù)r=0.9992；水產品中敵百蟲的添加回收率在89.0%～93.8%，相對標準偏差為2.1%～5.4%，檢出限為1.0μg/kg。方法簡便、快速、準確，保留時間為1.5min。

液相色譜-質譜/質譜聯(lián)用；敵百蟲；水產品；殘留

敵百蟲屬有機磷脂類化合物，是一種低毒的廣譜殺蟲劑。敵百蟲在水產養(yǎng)殖中多用于防治魚體內、外的寄生蟲病以及清除水中有害生物[1-3]。過量使用敵百蟲會造成殘留藥物污染，對人畜安全造成一定影響。最近的研究發(fā)現(xiàn)，敵百蟲作為膽堿能抑制劑除了具有急性毒性外，還可引發(fā)遲發(fā)性神經毒性及導致其他慢性毒性癥狀。動物試驗顯示，敵百蟲可引起腦皮層神經細胞凋亡，但發(fā)生機制并不清楚[4]。

敵百蟲殘留分析方法已有許多報道，主要為氣相色譜法[5-7]和氣質聯(lián)用法[8-11]，但由于敵百蟲熱穩(wěn)定性差，在氣相色譜分析過程中很容易發(fā)生分解，影響敵百蟲的定量分析。很少有用液質聯(lián)用法分析敵百蟲殘留量[12-13]，特別是水產品中的敵百蟲殘留分析還未見報道。本實驗用液質聯(lián)用分析水產品中的敵百蟲殘留量，分析步驟簡單，靈敏度高，可完全滿足歐盟、美國FDA和日本等發(fā)達國家的限量要求。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鰻魚 送檢樣品。

甲醇(色譜純)、乙腈(分析純)、丙酮(分析純)、二氯甲烷(分析純)、甲酸(色譜純)、乙酸乙酯(分析純)；水為二次蒸餾水；酸性氧化鋁固相萃取柱(1000mg/6mL)；敵百蟲標準品(95.0%)。

敵百蟲標準品溶液的配制：稱取10mg的敵百蟲標準品，用甲醇溶解于100mL容量瓶中，配成100μg/mL的標準儲備液，使用時根據需要以流動相稀釋成標準工作液。

ACQUITY UPLCTM-TQD MS/MS系統(tǒng) 美國Waters公司；R205旋轉蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司；E120H超聲波清洗器 德國ELMA公司；MS3渦旋混合器 德國IKA公司；Milli-Q純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 提取

稱取2g(精確到0.01g)試樣于50mL具塞塑料離心管中，加乙酸乙酯15mL，再加入1g無水硫酸鈉，在混勻器上充分混勻2min，5000r/min離心5min，將上層乙酸乙酯溶液移至50mL濃縮瓶中，殘渣加乙酸乙酯15mL，重復上述操作，合并兩次提取液，在40℃水浴減壓濃縮至約5mL，待凈化。

1.2.2 凈化

將酸性氧化鋁柱用5mL酸化乙酸乙酯活化，棄去流出液。將提取液過柱，用10mL試管收集，待樣液完全流出后，再向小柱中加入5mL乙酸乙酯淋洗，凈化液于40℃水浴減壓濃縮至干，加入1mL流動相溶解，混勻，過0.2μm濾膜，供UPLC-MS/MS測定。

1.2.3 色譜質譜條件

色譜柱：UPLC ACQUITY BEH (50mm×2.1mm，1.7μm)；流動相：甲醇-0.1%甲酸溶液(35:65，V/V)；流速：0.2mL/min；柱溫：40℃；進樣量：5μL；離子源：ESI，正離子模式；毛細管電壓：4.0kV；離子源溫度：105℃；脫溶劑氣溫度350℃；脫溶劑氣流量：600L/hr；錐孔反吹氣流量50L/h；錐孔電壓：40V；掃描方式：多反應監(jiān)測(MRM)；離子對：m/z 259.4/109.1(定性離子對)，m/z 259.4/221.1(定量離子對)。

2 結果與分析

2.1 提取試劑的選擇

農藥殘留分析中對使用的溶劑要求是非常高的，即要求提取回收率高、雜質干擾小、經濟、環(huán)境友好等。提取溶劑的選擇直接影響到提取效果的好壞，有機磷農藥是親酯性化合物，易溶于有機溶劑。水產品中的敵百蟲主要用二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙腈等極性較大的溶劑進行提取[14-17]，本實驗選擇并比較丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈作為提取溶劑時的提取效率。結果表明：用乙酸乙酯和乙腈作為提取溶劑均能獲得較高的添加回收率。乙腈的提取效率高，雜質干擾小，但是考慮到乙腈的毒性較大，對環(huán)境不友好，所以最終確定乙酸乙酯作為水產品中敵百蟲殘留分析的提取溶劑。

2.2 凈化條件的選擇

考慮到用乙酸乙酯提取水產品中殘留的敵百蟲時會將水產品中的脂肪一并提取出來。所以提取后必須選擇一種合適的凈化方法將提取液中的脂肪除去。經過比較，最終確定酸性氧化鋁固相萃取小柱(1000mg/6mL)能夠很好地除去樣品中的脂肪。

2.3 標準曲線及線性范圍

使用基質匹配標準溶液建立標準曲線對樣品進行定量，可以消除基質中其他組分對目標分析物的干擾[18]。用流動相準確配制5、10、50、100、200ng/mL標準工作溶液。在儀器測定條件下進行分析，以被測組分峰面積(Y)對其質量濃度(X)作工作曲線。結果表明，在0.02～0.8ng/mL范圍內，敵百蟲標準工作溶液的色譜峰面積與質量濃度成良好的線性關系，其線性方程為Y =2230X＋2790(r=0.9992)。該測定條件下敵百蟲標準溶液保留時間約為1.5min，以3倍信噪比計，最低檢出限為1.0μg/kg，標準溶液離子流圖見圖1。

圖1 敵百蟲標準溶液的離子流圖Fig.1 Selected ion chromatogram of trichlorphon standard

2.4 方法的準確度和精密度實驗

以不含敵百蟲的水產品樣品為本底，分別添加系列濃度的待測藥物標準溶液(添加水平分別為4、20、100μg/kg，進行添加回收實驗，重復測定5次，添加回收實驗結果見表1。結果表明，平均添加回收率為89.0%～93.8%，RSD為2.1%～5.4%。

表1 水產品中敵百蟲添加回收率和精密度(n=5)Table1 Recoveries and precisions of trichlorphon from fortified blank aquatic samples (n=5)

3 結 論

本實驗建立的UPLC-MS/MS方法適用于魚、蝦、貝類等水產品中敵百蟲的殘留分析，具有簡便快捷、靈敏度高等特點，添加回收率以及精密度均滿足殘留分析的要求[19-20]。

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Determination of Trichlorphon Residues in Aquatic Products Using UPLC-MS/MS

ZHA Yu-bing，YANG Chun-liang*，LIN Ling，LI Tao，CHENG Sheng-hua
(1. Agricultural Products Processing Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Zhanjiang 524001, China)

A UPLC-MS/MS method was developed to determine trichlorphon residues in aquatic products. Trichlorphon residues in samples were extracted into ethyl acetate, defatted on an acidic alumina solid phase extraction column, separated by UPLC, measured by MS/MS in positive ion multiple reaction monitoring mode, and quantified by external standard method.Over the range of 0.02 to 0.8 ng/mL, an excellent linear relationship (r = 0.9992) between trichlorphon concentration and peak area was observed for the standard working solution of trichlorphon. The average spike recoveries for trichlorphon in blank samples ranged from 89.0 % to 93.8 %, with a RSD between 2.1% and 5.4%. The detection limit for trichlorphon was 1μg/kg.This method proved simple, rapid and accurate.

UPLC-MS/MS；trichlorfon；aquatic products；residues

TS207.5

A

1002-6630(2011)08-0278-03

2010-07-01

查玉兵(1977—)，男，助理研究員，碩士，研究方向為農藥殘留分析。E-mail：zhayubing2008@126.com

*通信作者：楊春亮(1964—)，男，研究員，碩士，研究方向為食品安全。E-mail：zjyangcl@yahoo.com.cn