周大寨，朱玉昌，王 進

(1.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學院生物科學與技術學院，湖北 恩施 445000)

藤茶中總黃酮的三波長紫外光譜法測定

周大寨1，朱玉昌1，王 進2

(1.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學院生物科學與技術學院，湖北 恩施 445000)

以乙醇為溶劑提取藤茶中總黃酮，用三氯化鋁作為顯色劑，采用三波長紫外光譜法進行定量。結果表明，黃酮質量濃度在0～40μg/mL內，分別在波長為λ1=322nm、λ2=311nm、λ3=296nm處測吸光度時，ΔA與質量濃度C之間呈良好的線性關系，回歸方程為ΔA=0.0171C＋0.0171，相關系數r=0.9978。方法的回收率為98.18%～102.79%，變異系數小于0.371%，具有良好的準確性和精密度。

藤茶；總黃酮；三波長紫外光譜法

藤茶，學名為顯齒蛇葡萄[Ampelopsis grossedentata(Hand-Mazz)W. T. Wang]，為葡萄科(Vitaceae Michx)蛇葡萄屬(Ampelopsis)的一種野生木質落葉藤本植物，屬典型類茶植物。藤茶中含有豐富的以二氫楊梅素為主的黃酮類成分，現代中藥藥理分析表明，這些黃酮類物質具有增強免疫[1]、抗炎抗菌[2-3]、降血糖、降血脂[4-5]，抗氧化[6-7]等保健功效。

近年來藤茶中總黃酮含量測定的方法以光譜法[8-9]和色譜法[10-11]為主。色譜法分離效果好，但定性難，且操作較為繁瑣，所需實驗材料及儀器較為嚴格。光譜法操作步驟簡單，分析速度快，且實驗條件一般實驗室均能達到，已成為定量定性分析較為普遍的方法?；谀壳把芯繜衢T的三波長光譜法能有效地消除吸收峰不對稱給定量分析造成的影響，并校正基于干擾組分的吸收光譜具有可能是散射造成的背景產生的基線傾斜，本實驗擬建立定量藤茶中總黃酮的三波長光譜法，為建立適合藤茶的質量標準提供新的判斷依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藤茶由恩施來鳳縣向班貴藤茶有限公司提供，干燥后粉碎，過100目篩，裝瓶備用。

丙酮(AR)、95%乙醇(AR)、三氯化鋁(AR)、98%二氫楊梅素樣品(色譜純)，實驗所用水均為二重蒸餾水。

1.2 儀器與設備

BT224S型電子天平 德國賽多利斯集團； HSW12型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 方法原理[12]

三波長分光光度法的基本原理如圖1所示。在吸收光譜曲線上，用作圖法適當地選擇3個波長λ1、λ2、λ3，并在這3個波長處測定其吸光度A1、A2、A3。

圖1 三波長光譜法的基本原理示意圖[12]Fig.1 Principle of three-wavelength spectrophotometric method

式中：ε為待測組分在各波長處的摩爾吸光系數；b為光程；c為待測組分的濃度。由公式(1)可知，ΔA值與待測組分的濃度成正比，可用于對待測組分的測定。從圖1可知，在所選擇的3個波長處，如果相應的吸收光譜曲線上的3點在一條直線上，則測得的ΔA值為零，而當干擾成分產生的吸收光譜為一條直線時，則按上述方法選擇3個測定波長得到的ΔA值與干擾成分的濃度無關，因此三波長光譜法有效地消除了吸收峰不對稱給定量分析造成的影響，提高了定量分析的準確度。1.3.2 藤茶中總黃酮的提取

圖2 藤茶提取液與二氫楊梅素對照品的吸收光譜Fig.2 Comparison of UV absorption spectra of Ampelopsis grossedentata extract and dihydromyricetin standard

稱取藤茶干粉1.5g，用濾紙包好，置于索氏提取裝置中，在燒瓶中裝入適量石油醚，50℃水浴鍋回流2～3h，回收石油醚，向燒瓶中再加入95%乙醇溶液約250mL，90℃水浴提取5～6h，收集提取液，95%乙醇定容至250mL。

2 結果與分析

2.1 測定波長選擇

準確吸取二氫楊梅素儲備液1.0mL注入10mL容量瓶中，加入質量分數3%三氯化鋁溶液3mL，95%乙醇溶液充分混合至刻度，以未加測定物的95%乙醇溶液做參比，在波長250～400nm范圍內掃描，繪制其吸收曲線(圖3)。二氫楊梅素的最大吸收波長為311nm，其他雜質在此波長處也有一定的吸收，在二氫楊梅素的紫外吸收曲線上先選擇296nm和262nm兩個波長，連接這兩點交于322nm波長附近，在這3個波長處，二氫楊梅素的ΔA值較大，而雜質的ΔA值幾乎等于零，因此以296、311、322nm為三波長法定量測定藤茶中總黃酮的測定波長。

圖3 三波長的確定Fig.3 Optimum wavelengths for flavonoid determination

2.2 標準曲線的繪制

準確吸取質量濃度為130μg/mL二氫楊梅素標準溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL分別注入10mL容量瓶中，加入質量分數3%的三氯化鋁溶液3mL，95%的乙醇溶液充分混合至刻度，在λ1=322nm、λ2=311nm、λ3=296nm分別測得吸光度，按公式(1)計算ΔA，求得ΔA與質量濃度關系的回歸方程為ΔA=0.0171C＋0.0171，相關系數r=0.9978，說明黃酮質量濃度在0～40μg/mL內，分別在波長為λ1=322nm、λ2=311nm、λ3=296nm處測吸光度時，ΔA與質量濃度C之間呈良好的線性關系。

2.3 回收率和方法精密度實驗

按上述實驗方法制備4個不同濃度梯度的樣品，分別加入2個不同濃度的標準品，在測定波長下測定ΔA，求得其平均回收率、標準偏差及變異系數，結果見表1、2。

表1 加標回收率實驗Table 1 Spike recovery of the method

表2 精密度實驗(n=5)Table 2 Precision of the method (n=5)

由表1、2可以看出，本法的回收率為98.18%～102.79%，變異系數小于0.371%，方法的準確度與精密度均較高。由于ΔA值與黃酮的質量濃度呈正比，在所選擇的3個波長處，其相應的吸收光譜曲線上3點在一條直線上，有效地消除了本底漂移及吸收峰不對稱給定量分析造成的影響，因此三波長紫外光譜法為測定藤茶中總黃酮含量提供了更準確可行的方法。

2.4 穩(wěn)定性實驗

用與繪制吸收曲線相同的方法配制樣品，進行穩(wěn)定性實驗。結果表明，樣品在室溫放置24h，測得其吸光度基本不變(圖4)。

圖4 黃酮穩(wěn)定性實驗Fig.4 Stability of the method

2.5 藤茶中總黃酮含量的測定

表3 藤茶中總黃酮含量測定Table 3 Results of determining total flavonoid contents in Ampelopsis grossendentata by the method

吸取藤茶提取液0.1mL置于10mL容量瓶中，按上述實驗方法測定吸光度，計算ΔA，根據標準曲線方程計算總黃酮含量，分析結果見表3。有關藤茶總黃酮的報告中含量最高為44%[13]，本實驗測得的總黃酮得率高于文獻報道值，這可能與原料來源、提取及分析方法不同有關。

3 討 論

隨著對藤茶化學成分、藥理功能研究的深入[14]，對藤茶進行大規(guī)模的開發(fā)與利用也在同步進行[15-16]。鑒于該植物有不同的產地、不同的品種、采摘有不同的季節(jié)，而不同來源的材料其有效成分的含量與組成不一。為建立一個統(tǒng)一的評價標準，以其中黃酮類化合物的含量作為一個衡量指標是最合理且最簡便的。

在同樣的實驗條件下，三波長光譜法優(yōu)于單波長光譜法體現在兩個方面，一是三波長光譜法選取了干擾組分吸收曲線上吸光度位于同一直線上的3個點作為測試波長，不但消除了干擾組分的干擾，而且對于基線平行的零次曲線或成一條直線的一次曲線均有抗干擾作用，其抗干擾能力較單波長光譜法更佳[17]；二是基于特定的ΔA計算公式，在對定量信息ΔA的貢獻上，吸收曲線坡度平坦從而測量誤差小的吸收峰處的吸光度貢獻大些，權重系數大，吸收曲線坡度較陡處的吸收度貢獻小些，權重系數小，這樣，從誤差的傳遞上弱化了大誤差的影響，保障了測定結果的準確度。由此，可得出結論：三波長光譜法較單波長光譜法測定藤茶中總黃酮含量，可信度、準確度更高，可作為控制藤茶質量的一種新方法。

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Determination of Total Flavonoids in Ampelopsis grossedentata by Three-wavelength UV Spectrophotometry

ZHOU Da-zhai1，ZHU Yu-chang1，WANG Jin2
(1. Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province, Enshi 445000, China；2. School of Biological Science and Technology, Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000, China)

A three-wavelength UV spectrophotometric method was proposed for the determination of total flavonoid content in Ampelopsis grossedentata. Samples were extracted with ethanol, and the extract was then detected colorimetrically with aluminum chloride as chromogenic agent at the wavelengths of 322, 311 nm and 296 nm. The regression equation of the proposed method was obtained as follows: ΔA = 0.0171C＋0.0171, which exhibited good linearity in the range of 0 to 40μg/mL, with a correlation coefficient r of 0.9978. The spike recoveries at two spiked levels were between 98.18% and 102.79%, and the precision RSDs (n = 5) were less than or equal to 0.371%. Thus, this method is accurate and precise.

Ampelopsis grossedentata；flavonoids；three-wavelength UV spectrophotometry

O657.3

A

1002-6630(2011)08-0235-03

2010-06-25

湖北省自然科學基金項目(2009CDA155)；武漢市科技攻關項目(200920322147)；湖北省教育廳B類項目(B20101906)

周大寨(1976—)，男，實驗師，碩士，研究方向為天然產物及其開發(fā)。E-mail：sws0048@163.com