凌 云，儲(chǔ)曉剛，孫 利，張 峰，王 菡,3，陳 琦,4，吳永寧*

(1.中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所，北京 100021；2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100025；3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；4.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 712081)

香腸中紅色2G的HPLC法及UPLC-MS/MS檢測

凌 云1,2，儲(chǔ)曉剛2，孫 利2，張 峰2，王 菡2,3，陳 琦2,4，吳永寧1,*

(1.中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所，北京 100021；2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100025；3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；4.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 712081)

建立香腸中紅色2G色素的高效液相色譜法(HPLC)測定和確證的超高壓液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)。以0.662mol/L氨水為提取液，樣品均質(zhì)提取兩次，離心后用C18柱凈化，采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)檢測，流動(dòng)相為乙酸-乙酸銨緩沖液-甲醇(55:45，V/V)，等度洗脫，流速為1mL/min，檢測波長為530nm，陽性結(jié)果用UPLC-MS/MS確證。HPLC-DAD法在0.0212～1.06mg/L范圍內(nèi)，紅色2G的峰面積與其相應(yīng)濃度呈現(xiàn)良好相關(guān)性，r＞0.999，方法測定限為0.106mg/kg，在空白樣品中添加已知濃度的紅色2G色素，平均回收率在79.0%～86.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在3.19%～5.06%之間。UPLC-MS/MS法的測定限為0.005mg/kg，平均回收率在75.5%～80.2%之間，RSD在3.62%～9.97%之間。該方法可用于香腸中紅色2G的檢測及確證。

紅色2G；色素；香腸；高效液相色譜；超高壓液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；確證

紅色2G(Red 2G)，別名食品紅10號(hào)，為單偶氮化合物，溶于水，微溶于乙醇，分子式為C18H13N3Na2O8S2，相對(duì)分子質(zhì)量509，為人工合成色素，常作為食品加工中的紅色色素，著色力強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，不易褪色。因其可能具有致癌性[1]，歐盟委員會(huì)已宣布在歐盟范圍內(nèi)禁止使用該色素[2]，中國也已禁止使用紅色2G作為食品添加劑[3]。

我國關(guān)于人工合成色素檢測方法的國家標(biāo)準(zhǔn)有5項(xiàng)[4-8]，尚沒有紅色2G檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)。王全林等[9]建立了二極管陣列高效液相色譜法測定食品中紅色2G，但前處理較為復(fù)雜。國外關(guān)于紅色2G的分析方法有分光光度計(jì)法、液相色譜法(HPLC)、毛細(xì)管電泳法及液質(zhì)聯(lián)用方法[10-15]，但這些方法檢測限較高，液質(zhì)方法僅為液相色譜-單級(jí)四級(jí)桿質(zhì)譜法。本實(shí)驗(yàn)建立香腸中紅色2G的HPLC分析方法，提高方法的靈敏度，同時(shí)用超高壓液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜確證技術(shù)(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS/MS)確證陽性結(jié)果，并簡化樣品前處理步驟，為香腸中紅色2G的測定提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅色2G標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞99.0%) 瑞士Fluka公司。氨水、乙酸、乙酸銨為分析純；甲醇為色譜純；乙酸-乙酸銨緩沖液：稱取1.554g乙酸銨溶于900mL水中，加入1mL乙酸，定容至1.00L，pH4.7；標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配制成1060mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃保存。

1.2 儀器與設(shè)備

C18固相萃取柱(500mg/6mL)、1100高效液相色譜儀(配有二極管陣列檢測器(DAD)) 美國Agilent公司；超高效液相色相色譜-Quattro Premier三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源(ESI))、固相萃取裝置 美國Waters公司；萬分之一分析天平；3K30冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；酸度計(jì) 日本Horiba公司；超純水器 美國Millipore公司；高速均質(zhì)器 美國Omniglh公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取與凈化

將待測肉樣品切碎，稱取肉碎末5.00g，置于50mL離心管中，加入15mL 0.662mol/L氨水，均質(zhì)約2min，30000×g離心10min，取出上清液，殘余物再重復(fù)上述操作一次，合并上清液，用水定容至50mL，取出20mL，用乙酸調(diào)pH值至5～6之間，10000×g離心5min，吸取上清液，殘余物用5mL蒸餾水提取兩次，合并上清液。C18柱用4mL甲醇及4mL水活化后，將樣品提取液全部加樣到凈化柱中，先用4mL水淋洗，再用4mL水-甲醇(1:1)洗脫，將洗脫液收集，并定容至5mL，20000×g離心5min后供HPLC-DAD或UPLC-MS/MS分析。

1.3.2 HPLC測定條件

色譜柱：Waters Atlantis C18(4.6mm×250mm，5.0μm)；柱箱溫度：30℃；流動(dòng)相：乙酸-乙酸銨緩沖液-甲醇(55:45)，等度洗脫，流速為1mL/min；進(jìn)樣量：20μL；檢測波長：530nm。

1.3.3 UPLC-MS/MS測定條件

色譜柱：Waters Acquity BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)；流動(dòng)相：乙腈-乙酸銨緩沖液(2mmol/L)，梯度淋洗，初始條件：0～2min 10%乙腈線性上升至45%，2～3min乙腈保持45%，3～3.1min 45%乙腈下降至10%，流速：0.3mL/min；進(jìn)樣量：10μL。質(zhì)譜條件：采用電噴霧負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)控掃描模式：m/z 231.7＞157.9，碰撞能量，15eV；m/z 231.7＞178.9，碰撞能量，10eV；毛細(xì)管電壓：2.75kV；錐孔電壓：26.74V；源溫度：110℃；脫溶劑氣溫度：400℃；脫溶劑氣流量：650L/h；電子倍增電壓：650V。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取

紅色2G屬于人工合成色素，極易與蛋白質(zhì)結(jié)合或被吸附。本實(shí)驗(yàn)采用0.662mol/L氨水的均質(zhì)提取，蛋白質(zhì)溶解度提高，吸附的色素被釋放，能夠提高提取效率。但是，實(shí)驗(yàn)過程中用乙酸調(diào)節(jié)提取液pH值時(shí)，由于蛋白質(zhì)鹽析，產(chǎn)生大量沉淀。稱取香腸樣品，添加1.00mg/kg紅色2G，對(duì)比以下兩種前處理方法的回收率：樣品均質(zhì)提取后，用乙酸調(diào)pH值，離心定容后，取部分樣液注入液相色譜儀測定，添加回收率只有51.4%；而樣品均質(zhì)提取后，用乙酸調(diào)pH值，離心后沉淀用5mL蒸餾水提取兩次，將所有提取液合并后定容，取部分樣液注入液相色譜儀測定，添加回收率為82.3%，可見在蛋白質(zhì)沉淀過程中共沉淀作用降低了紅色2G的回收率。

2.2 樣品凈化

Minioti采用HPLC法測定水溶性食品中13種人工合成色素[4]，水提取液過濾后直接分析，沒有樣品凈化步驟，本實(shí)驗(yàn)涉及的樣品基質(zhì)是肉類食品，提取液中的少量脂肪和蛋白質(zhì)對(duì)分析產(chǎn)生影響。量取1μg的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用10mL 氨水(0.662mol/L)稀釋，并用乙酸調(diào)整pH值為5～6后加到C18柱上，經(jīng)4mL水淋洗，4mL水-甲醇(1:1)洗脫，收集洗脫液測定，結(jié)果表明紅色2G的回收率達(dá)到104%，可見通過調(diào)節(jié)pH值使紅色2G吸附于C18柱上，甲醇-水(1:1)能夠?qū)⑵淙肯疵摚蔬x用C18柱進(jìn)行樣品凈化，既能去除樣品中大分子干擾，還能確保目標(biāo)組分的回收。

2.3 HPLC法

2.3.1 檢測波長的選擇

吸取424ng/mL的紅色2G標(biāo)準(zhǔn)溶液，注入HPLC，記錄二極管陣列掃描圖(200～800nm)，圖1為紅色2G的紫外-可見光譜圖，在235、311、505、530nm都有較強(qiáng)的吸收，由于530nm波長處的吸收很強(qiáng)，同時(shí)可見區(qū)干擾較小，故選其作為檢測波長。

圖1 紅色2G的紫外-可見光譜圖Fig.1 UV-Vis spectrum of Red 2G

2.3.2 流動(dòng)相的選擇

紅色2G屬于單偶氮化合物，且為磺酸鈉鹽，流動(dòng)相的pH值對(duì)其分離影響較大。本實(shí)驗(yàn)比較甲醇-水作為流動(dòng)相和甲醇-緩沖溶液(乙酸-乙酸銨)的差別，發(fā)現(xiàn)采用前者作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫時(shí)，色譜峰前伸，峰形差，選擇甲醇-緩沖溶液(乙酸-乙酸銨)后，峰形得到有效的改善。

圖2 流動(dòng)相對(duì)紅色2G分離的影響Fig.2 Effect of mobile phase composition on red 2G separation

2.3.3 線性實(shí)驗(yàn)

吸取紅色2G標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用超純水稀釋為0.0212、0.0424、0.0530、0.106、0.212、0.424、0.636、1.06mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，依次注入HPLC分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的相應(yīng)峰面積對(duì)應(yīng)其質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸計(jì)算，線性方程為 y=0.0311x－ 0.1418(r=0.9996)。

2.3.4 方法的加標(biāo)回收及精密度、測定限

將3個(gè)不同添加水平的紅色2G標(biāo)準(zhǔn)溶液分別添加于香腸樣品中，具體添加水平見表1。每個(gè)添加水平平行測定6次，紅色2G的平均回收率在79.0%～86.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在3.19%～5.06%之間，結(jié)果見表1。按信噪比RSN=10計(jì)算紅色2G的測定限為0.106mg/kg。

表1 HPLC方法的加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Table 1 Accuracy and precision of HPLC method (n＝6)

2.4 UPLC-MS/MS確證方法

以準(zhǔn)分子離子峰[M-2Na]2-為母離子(m/z=231.7)進(jìn)行掃描，選擇豐度較高的碎片峰[M-2Na-C4H6-N2]2-和[M-2Na-C4H6-N2-COCH2]2-作為子離子，m/z分別為178.9和157.9，m/z=157.9碎片峰的優(yōu)化碰撞電壓為15eV；m/z178.9碎片峰的優(yōu)化碰撞電壓為10eV，m/z178.9與m/z157.9的離子比率為1.3:1.0。在儀器的檢測限為0.001mg/L(信噪比RSN=3)，將2個(gè)不同濃度水平的紅色2G標(biāo)準(zhǔn)溶液分別添加于香腸樣品中，具體添加水平見表2，按以上樣品處理方法操作并測定，每個(gè)添加水平平行測定6次，紅色2G的平均回收率在75.5%～80.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在3.62%～9.97%之間，結(jié)果見表2。按信噪比RSN=10計(jì)算紅色2G的測定限為0.005mg/kg，圖3為紅色2G的標(biāo)準(zhǔn)譜圖(標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度為0.212mg/L)及標(biāo)準(zhǔn)添加樣品譜圖(標(biāo)準(zhǔn)添加水平為0.200mg/kg)。

表2 UPLC-MS/MS方法的準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Table 2 Accuracy and precision of UPLC/MS/MS method (n＝6)

圖3 紅色2G的UPLC/MS/MS譜圖Fig.3 UPLC/MS/MS chromatography of red 2G

2.5 實(shí)際樣品測定

從超市購買6種品牌的香腸用所建立的方法進(jìn)行測定，均未檢出紅色2G。

3 結(jié) 論

本研究建立香腸中紅色2G的HPLC分析方法和UPLC-MS/MS確證方法。通過線性、準(zhǔn)確度、精密度實(shí)驗(yàn)以及樣品的測定，驗(yàn)證了方法的可行性。本方法靈敏度高，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，使用范圍廣。

[1] Commission Regulation (EC) No 884/2007 of 26 July 2007on emergency measures suspending the use of E 128 Red 2G as food colour[J].Official Journal of the European Union, 2007, L195: 8-9.

[2] European Food Safety Authority. Opinion of the scientific panel on food additives, flavourings, processing aids and materials in contact with food(AFC) on the food colour Red 2G (E128) based on a request from the Commission related to the re-evaluation of all permitted food additives[EB/OL].(2007-07-16)[2010-06-17].http://www.efsa.europa.eu/EFSA/efsa_locale-1178620753812_1178624461311.htm.

[3] 中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所. GB/T 2760—2007食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2007.

[4] GB/T 5009.35—2003 食品中合成著色劑的測定[S].

[5] GB/T 5009.141－2003 食品中誘惑紅的測定 [S].

[6] GB/T 9695.6—2008 肉制品中胭脂紅著色劑的測定[S].

[7] GB/T 21916—2008 水果罐頭中合成著色劑的測定高效液相色譜法[S].

[8] GB/T 21912—2008 食品中二氧化鈦的測定[S].

[9] 王全林, 應(yīng)路, 張書芬, 等. 二極管陣列高效液相色譜法測定食品中紅色2G[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(2): 164-167.

[10] MINIOTI K S, SAKELLARIOU C F, THOMAIDIS N S. Determination of 13 synthetic food colorants in water-soluble foods by reversedphase high-performance liquid chromatography coupled with diode-array detector[J]. Anal Chim Acta, 2007, 583(1): 103-110.

[11] RYVOLOVA M, TABORSKY P, VRABEL P, et al. Sensitive determination of erythrosine and other red food colorants using capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection[J]. J Chromatogr A,2007, 1141(2): 206-211.

[12] ISHIKAWA F, SHIGEOKA S, NAGASHIMA M, et al. Analytical method of 21 coal-tar dyes in protein-rich foods by solid-phase extraction and HPLC[J]. Journal of Food and Hygiene Society of Japan, 2000, 41(3): 194-199.

[13] ISHIKAWA F, OISHI M, SHINDO T, et al. Confirmation of nonpermitted detected dyes in akasu (red vinegar) by LC/MS[J]. Shokuhin Eiseigaku Zasshi, 2005, 46(5): 228-233.

[14] YOSHIOKA N, ICHIHASHI K. Determination of 40 synthetic food colors in drinks and candies by high-performance liquid chromatography using a short column with photodiode array detection[J]. Talanta, 2008,74(5): 1408-1413.

[15] ZALACAIN A, ORDOUDI S A, BLAZQUEZ I, et al. Screening method for the detection of artificial colours in saffron using derivative UV-Vis spectrometry after precipitation of crocetin[J]. Food Addit Contam, 2005,22(7): 607-615.

Determination of Red 2G in Sausage by High-performance Liquid Chromatography and Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

LING Yun1,2，CHU Xiao-gang2，SUN Li2，ZHANG Feng2，WANG Han2,3，CHEN Qi2,4，WU Yong-ning1,*
(1. Institute of Nutrition and Food Safety, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100021, China；2. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100025, China；3. College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China；4. College of Life Science and Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an 712081, China)

A high-performance liquid chromatography method (HPLC) was developed for the determination of red 2G in sausage. Sausage samples were extracted twice with 0.662 mol/L NH3·H2O and the extract was cleaned up on a C18 column.Red 2G was analyzed by HPLC with diode array detector and confirmed by UPLC-MS/MS. The limit of quantification (LOQ)of HPLC was 0.106 mg/kg and the average recoveries ranged from 79.0% to 86.5% with RSD values between 3.19% and 5.06%.The LOQ of UPLC-MS/MS was 0.005 mg/kg and the average recoveries ranged from 75.5% to 80.2% with RSD values between 3.62% and 9.97%. The developed HPLC method and UPLC-MS method can be applied for the determination and confirmation of red 2G in sausage.

red 2G；color；sausage；high-performance liquid chromatography (HPLC)；ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)；confirmation

R155.5

A

1002-6630(2011)08-0231-04

2010-06-17

北京市科技計(jì)劃項(xiàng)目(D08050200310804)

凌云(1979—)，女，助理研究員，博士研究生，研究方向?yàn)闋I養(yǎng)與食品衛(wèi)生。E-mail：lingyun_505@163.com

*通信作者：吳永寧(1962—)，男，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称沸l(wèi)生。E-mail：wuyn@public.bta.net.cn