祝儒剛，呂淑霞*，劉月萍，張 良

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.遼寧大學(xué)輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院，遼寧 沈陽 110036；3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

基于DNA染料EMA的RT-PCR技術(shù)定量檢測海產(chǎn)品中病原性副溶血弧菌活細(xì)胞

祝儒剛1,2，呂淑霞1,3,*，劉月萍3，張 良3

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.遼寧大學(xué)輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院，遼寧 沈陽 110036；3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

將一種DNA染料疊氮溴化乙錠(ethidium bromide monoazide，EMA)與實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)相結(jié)合，建立一種能選擇性定量檢測牡蠣中trh陽性副溶血弧菌活細(xì)胞的新方法。結(jié)果表明：使EMA成功插入死細(xì)胞DNA并且光解溶液中游離EMA的最佳曝光時(shí)間為20min；不抑制副溶血弧菌活細(xì)胞DNA擴(kuò)增的最大EMA質(zhì)量濃度為2.0μg/mL；完全抑制熱致死細(xì)胞DNA擴(kuò)增的最小EMA質(zhì)量濃度為1.0μg/mL；人工污染牡蠣樣品，不經(jīng)過富集，在2.0×103～2.0×107CFU范圍內(nèi)細(xì)胞數(shù)的常用對數(shù)值與Ct值之間呈嚴(yán)格的負(fù)相關(guān)性，并且純培養(yǎng)與人工污染牡蠣樣品的RT-PCR檢測限均為2×103CFU，即人工污染牡蠣樣品的RT-PCR檢測靈敏度為每克牡蠣樣品400個(gè)活細(xì)胞；凍融實(shí)驗(yàn)表明，在溫度低于55℃的水浴中對冷凍海產(chǎn)品進(jìn)行解凍時(shí)，凍融過程對副溶血弧菌活細(xì)胞幾乎沒有影響。該方法是一種快速、靈敏且能有效鑒別并定量檢測病原活細(xì)胞的新方法。

疊氮溴化乙錠(EMA)；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)；海產(chǎn)品；副溶血弧菌；活細(xì)胞

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，它作為人類食源性致病菌能引起腸胃炎和敗血癥。副溶血弧菌廣泛分布于自然界，尤其以海產(chǎn)品攜帶率最高，因此副溶血弧菌是沿海一帶引起食物中毒和急性腹瀉的重要病原菌，近年來，我國尤其是南部沿海地區(qū)均有因食用副溶血弧菌引起食物中毒報(bào)道。目前，副溶血弧菌引起食物中毒的發(fā)生規(guī)模以及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢，已成為我國首要的食源性致病菌[1-2]。

目前的研究認(rèn)為，副溶血弧菌產(chǎn)生的毒素有溶血素和尿素酶。其致病因子主要有耐熱直接溶血毒素(thermostabile direct hemolysin，TDH)、耐熱直接相關(guān)溶血毒素(TDH-related hemolysin，TRH)、不耐熱溶血毒素(thermolabile hemolysin，TLH)，分別由相關(guān)的tdh、trh和tlh基因編碼。TDH和TRH與副溶血弧菌的致病能力關(guān)系密切。臨床分離的副溶血弧菌中超過90%為tdh陽性菌株，而環(huán)境中食物感染的潛在致病菌均為trh陽性副溶血弧菌，而且由該菌引起的食物感染和中毒事件呈上升趨勢[3-5]?？焖贆z測和診斷是及早預(yù)防控制副溶血弧菌食物中毒的發(fā)生的關(guān)鍵。

隨著人們食品安全意識的提高，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ploymerase chain reaction，PCR)技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢在食品安全控制和臨床診斷上得到越來越多的運(yùn)用。實(shí)時(shí)定量PCR的出現(xiàn)，更是將PCR檢測技術(shù)提高到定量的水平，并且檢測靈敏度得到進(jìn)一步提高[6-7]。然而，用PCR方法檢測病原性副溶血弧菌污染時(shí)，它不能區(qū)分所檢測到的副溶血弧菌是活細(xì)胞還是死細(xì)胞。因此，利用PCR選擇性擴(kuò)增副溶血弧菌活細(xì)胞DNA面臨巨大挑戰(zhàn)。近年來，人們嘗試各種方法通過PCR技術(shù)僅僅檢測樣品中的活菌，例如mRNA的檢測，以及利用能夠與核酸共價(jià)結(jié)合的染料，這種染料能夠選擇性地滲透到死細(xì)胞內(nèi)部與細(xì)胞內(nèi)的DNA共價(jià)結(jié)合。在所有這些方法中，一種DNA插入型染料疊氮溴化乙錠(ethidium bromide monoazide，EMA)，展現(xiàn)出了很大的應(yīng)用潛力。許多研究[8-11]表明，EMA與PCR技術(shù)相結(jié)合，能夠成功地選擇性抑制樣品中死細(xì)胞的DNA擴(kuò)增，以便于更加精確地檢測樣品中活菌細(xì)胞的存在。

目前，EMA與RT-PCR檢測技術(shù)相結(jié)合來檢測并定量海產(chǎn)品中病原性副溶血弧菌活細(xì)胞仍未見報(bào)道。本研究將EMA選擇滲透性和RT-PCR特異性和靈敏性相結(jié)合，從而建立一種快速、靈敏并能夠有效檢測并定量海產(chǎn)品中病原性副溶血弧菌活細(xì)胞的新方法。

1 材料與方法

1.1 菌種

實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌株，副溶血弧菌ATCC17802，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑及培養(yǎng)基

疊氮溴化乙錠 美國Sigma公司；LightCycler 480 SYBR GreenⅠ(cat. no. 04 707 516 001)、熒光染料試劑盒美國Roche Diagnostics公司；胰胨肉湯(蛋白胨2%，NaCl 4%，0.01%的結(jié)晶紫0.5%，pH9.0)；T1N3(1%蛋白胨，3% NaCl，2%瓊脂)瓊脂。

1.3 儀器與設(shè)備

1.4 副溶血弧菌細(xì)胞熱處理

取37℃、150r/min條件下過夜培養(yǎng)的副溶血弧菌菌懸液，10000r/min離心5min。菌體沉淀用0.85%生理鹽水洗兩次，懸浮于0.85%的生理鹽水中。取定量菌懸液梯度稀釋，測定每個(gè)梯度的OD600nm并進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)。

調(diào)整菌懸液濃度為4×108CFU/mL，取0.5mL于離心管中，95℃水浴加熱10min，將經(jīng)過熱處理的0.5mL菌懸液冷卻至室溫后全部涂T1N3平板，37℃培養(yǎng)48h檢測是否仍有活菌存在。

1.5 完全抑制死細(xì)胞DNA擴(kuò)增的最小EMA質(zhì)量濃度確定[12-14]

用ddH2O配制0.1mg/mL的EMA溶液，－20℃避光保存。將EMA(0.1mg/mL)分別加入裝有0.5mL熱致死副溶血弧菌菌懸液(4×108CFU/mL)的12支離心管中，使EMA終質(zhì)量濃度分別達(dá)到0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2μg/mL。不加EMA 的一管作為陽性對照，0.5mL生理鹽水(不含細(xì)菌細(xì)胞)做為陰性對照。充分混勻后，將離心管黑暗中室溫放置約5min，讓EMA充分滲透到死細(xì)胞內(nèi)部并插入到細(xì)胞內(nèi)DNA雙螺旋上。然后將離心管開蓋放置冰上，距離燈管16cm，曝光20min。

1.6 不抑制活細(xì)胞DNA擴(kuò)增的最大EMA質(zhì)量濃度確定[15-16]

取EMA溶液(1mg/mL)分別加入裝有0.5mL活細(xì)胞菌懸液(4×108CFU/mL)的10支離心管中，使EMA終質(zhì)量濃度分別達(dá)到1、2、4、6、8、10、12、14、16μg/mL。充分混勻后，將離心管黑暗中室溫放置約5min。不加EMA的一管作為陽性對照，0.5mL生理鹽水(不含細(xì)菌細(xì)胞)做為陰性對照。然后將離心管開蓋放置冰上，距離燈管16cm，曝光20min。

1.7 EMA最佳曝光時(shí)間優(yōu)化

分別取0.5mL活細(xì)胞菌懸液(4×108CFU/mL)于9個(gè)離心管，加入4μL EMA使每管EMA(0.1mg/mL)終質(zhì)量濃度達(dá)到1.0μg/mL。充分混勻后，將離心管黑暗中室溫放置5min。然后將離心管開蓋放置冰上，距離燈管16cm，分別曝光0、5、10、15、20、15、30、35、40min。不加EMA的0.5mL活細(xì)胞菌懸液(4×108CFU/mL)做為陽性對照，0.5mL生理鹽水(不含細(xì)菌細(xì)胞)做為陰性對照。

1.8 RT-PCR鑒別死活細(xì)胞混合菌懸液中活細(xì)胞

完全一樣的9只離心管中分別加入0.25mL固定數(shù)量(2×107CFU)的熱致死細(xì)胞菌懸液與0.25mL變化數(shù)量(2×107、2 ×106、2 ×105、2 × 104、2 ×103、2 ×102CFU和20CFU)的活細(xì)胞菌懸液(生理鹽水洗滌2次)，混合均勻。另一組同樣9只完全相同的離心管，僅僅含有0.5mL變化數(shù)量(2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102CFU和20CFU)的活細(xì)胞菌懸液。第3組實(shí)驗(yàn)，9只相同的離心管中分別加入0.25mL固定數(shù)量(2×107CFU)的活細(xì)胞菌懸液與0.25mL變化數(shù)量(2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102CFU和20CFU)的熱致死細(xì)胞菌懸液。

每只離心管中加入0.1mg/mL EMA，使其終濃度達(dá)到1.0μg/mL。將菌懸液在黑暗中室溫放置5min，然后將離心管開蓋放置冰上，距離燈管16cm曝光20min。

1.9 人工污染實(shí)驗(yàn)

1.9.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作[17-18]

取過夜培養(yǎng)的副溶血弧菌(ATCC17802)菌懸液，菌體用滅菌生理鹽水洗滌兩次，調(diào)整菌懸液濃度為4×108CFU/mL。稀釋10倍，得到菌濃度范圍4×107～4CFU/mL。

無菌操作，每個(gè)濃度取1mL分別接種49mL滅菌胰胨肉湯液體培養(yǎng)基，混勻。另一組實(shí)驗(yàn)，牡蠣樣品來自當(dāng)?shù)睾．a(chǎn)品零售市場，在無菌均質(zhì)袋內(nèi)，無菌操作剪碎5g樣品于44mL滅菌胰胨肉湯液體培養(yǎng)基，利用高效自動均質(zhì)器均質(zhì)，同樣方法每個(gè)濃度取1mL分別接種、混勻。

吸取每個(gè)樣品10mL，800r/min離心10min，除去牡蠣細(xì)胞碎片，上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管10000r/min離心10min收集菌體。將菌體重懸于0.5mL無菌水中，添加EMA，使其終質(zhì)量濃度達(dá)到1.0μg/mL。將菌懸液在黑暗中室溫放置5min，然后將離心管開蓋放置冰上，距離燈管16cm曝光20min。曝光后的混合菌懸液在10000r/min離心5min，收集菌體。倒掉上清液后將菌體重懸在0.5mL的無菌水中，10000r/min再次離心5min，收集菌體，倒掉上清液，再次重懸在50μL無菌水中。

為確保牡蠣樣品不含trh陽性副溶血弧菌，取1g樣品加入50mL胰胨肉湯培養(yǎng)基中，37℃、150r/min過夜培養(yǎng)后，取菌液做RT-PCR鑒定。

1.9.2 RT-PCR鑒別經(jīng)凍融后菌懸液中的活細(xì)胞

過夜培養(yǎng)的副溶血弧菌菌懸液，菌體經(jīng)生理鹽水洗滌后調(diào)整其濃度為4×108CFU/mL。無菌操作分別取5g牡蠣組織于6只完全相同的無菌均質(zhì)袋內(nèi)，吸取1mL上述菌液人工污染，－20℃保存7d。冷凍樣品分別在不同溫度水浴中解凍，4℃解凍1h，25℃解凍30min，37、55、75、95℃分別解凍5min。解凍后的牡蠣組織添加無菌水至50mL，高效自動均質(zhì)器均質(zhì)。取10mL均質(zhì)勻漿，如上述方法離心后將收集的菌體重懸在1mL無菌水中，取0.5mL經(jīng)梯度稀釋后涂T1N3平板，每個(gè)梯度涂3個(gè)平板，37℃培養(yǎng)3d后計(jì)數(shù)。剩余0.5mL菌懸液經(jīng)EMA(終質(zhì)量濃度1.0μg/mL)處理后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。1.10 DNA模板制備[19-20]

用TZ裂解液(2.0% Triton X-100，2.5mg/mL疊氮化鈉，0.1mol/L Tris-HCl緩沖液，pH8.0)提取模板DNA。

經(jīng)EMA處理曝光后的菌懸液與等體積的2×TZ裂解液混勻，沸水浴10min后冷卻到室溫，10000r/min離心10min去掉菌體碎片沉淀，取上清液直接用作RT-PCR模板。

1.11 引物及RT-PCR擴(kuò)增

實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。病原性副溶血弧菌致病基因trh檢測引物上游(P1)為：5′-TTGCTTT CAGTTTGCTATTGGCT-3′；下游引物(P2)為：5′-GCT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC-3′，擴(kuò)增片段長度為300bp。20μL的擴(kuò)增體系包括：10μL熒光染料混合液，5μL模板DNA，上下游引物各1μL(1μmol/L)，3μL PCR級無菌水。RT-PCR反應(yīng)體系：94℃預(yù)變性10min，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94℃ 20s、55℃ 20s、72℃ 30s。每個(gè)RT-PCR反應(yīng)重復(fù)3次，得到平均Ct值和標(biāo)準(zhǔn)背離值。

1.12 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血弧菌熱處理

將菌懸液梯度稀釋，測定各梯度的OD600nm值，并取適量菌液涂平板，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)，37℃過夜培養(yǎng)，計(jì)算每個(gè)梯度的菌濃度。得到活菌的菌濃度隨OD600nm變化曲線，結(jié)果如圖1所示?？芍?，當(dāng)OD600nm為0.7時(shí)，菌濃度為4×108CFU/mL。

圖1 副溶血弧菌濃度與OD600nm的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Concentration dependence of OD600nm values in Vibrio.parahaemoliticus suspension

95℃水浴處理副溶血弧菌菌懸液(OD600nm為0.7，菌濃度4×108CFU/mL)10min，冷卻至室溫后將0.5mL菌液完全涂T1N3平板，37℃培養(yǎng)48h，無菌落生長。因此，濃度為4×108CFU/mL的副溶血弧菌菌懸液在95℃水浴處理10min，可將所有副溶血弧菌細(xì)胞全部被殺死，平板計(jì)數(shù)為零。

2.2 最佳EMA曝光時(shí)間

圖2 激活和完全光解游離EMA的最佳曝光時(shí)間優(yōu)化Fig.2 Optimization of light exposure time to activate DNA-bound EMA and to achieve complete photolysis of free EMA

在RT-PCR中，當(dāng)每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的熒光閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，定義為Ct值，熒光閾值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越少，擴(kuò)增曲線向右移動，其Ct值越大；相反，起始拷貝數(shù)越多，擴(kuò)增曲線向左移動，其Ct值越小。如圖2所示，陰性對照(不加模版)的Ct值是30.42±0.60。當(dāng)活菌細(xì)胞濃度為4×108CFU/mL時(shí)，隨著曝光時(shí)間的延長，各樣品Ct值逐漸減小，在曝光時(shí)間為15min時(shí)，其Ct值為22.94±0.66。經(jīng)曝光以后，未被光解的游離EMA會與細(xì)胞裂解釋放出來的DNA共價(jià)結(jié)合，從而抑制RT-PCR擴(kuò)增，導(dǎo)致Ct值增大。統(tǒng)計(jì)分析表明，當(dāng)曝光時(shí)間大于等于15min時(shí)，各樣品的Ct值與陽性對照(22.44±0.56)沒有顯著差異(P＜0.05)。因此，為了使游離EMA完全曝光光解，選擇20min為最佳曝光時(shí)間。

2.3 不抑制活細(xì)胞DNA擴(kuò)增的最大EMA質(zhì)量濃度

EMA的不同添加量對活菌RT-PCR擴(kuò)增的抑制作用如圖3所示。隨著EMA質(zhì)量濃度的不斷增大，各樣品Ct值也逐漸增加，表明EMA質(zhì)量濃度足夠大時(shí)對活菌的RT-PCR擴(kuò)增也有一定抑制作用。由圖3分析可知，當(dāng)EMA質(zhì)量濃度小于等于2μg/mL時(shí)，樣品Ct值與陽性對照Ct值(為18.67±0.45，不添加EMA)不具有統(tǒng)計(jì)顯著差異性，此時(shí)EMA對活細(xì)胞RT-PCR擴(kuò)增幾乎沒有抑制作用(P＞0.05)。然而，當(dāng)EMA質(zhì)量濃度大于等于4μg/mL時(shí)，EMA對活細(xì)胞RT-PCR擴(kuò)增具有顯著抑制作用，此時(shí)樣品Ct值與陽性對照具有統(tǒng)計(jì)顯著性差異(P＜0.05)。

圖3 不抑制活細(xì)胞DNA擴(kuò)增的最大EMA質(zhì)量濃度優(yōu)化Fig.3 Optimization of maximum EMA amount without inhibitory effect on DNA amplification from viable cells

2.4 完全抑制死細(xì)胞DNA擴(kuò)增的最小EMA濃度

如圖4所示，當(dāng)EMA質(zhì)量濃度為0.8μg/mL或更高時(shí)，所得到的Ct值均大于等于28.30±0.41，此時(shí)的Ct值與陰性對照(28.76±0.63)不具有統(tǒng)計(jì)顯著差異性，其產(chǎn)物溶解曲線Tm值為75℃(數(shù)據(jù)未提供)，可能為引物二聚體(P＞0.05)。表明，此時(shí)死細(xì)胞DNA的RT-PCR被完全抑制。相反，當(dāng)EMA質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6μg/mL時(shí)產(chǎn)物的溶解曲線Tm值均為81℃，此時(shí)的Ct值與陰性對照具有統(tǒng)計(jì)極顯著差異(P＜0.01)。此時(shí)，0.8μg/mL的EMA質(zhì)量濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于可以抑制活細(xì)胞RTPCR擴(kuò)增的EMA質(zhì)量濃度2μg/mL，因此，為了能夠使死細(xì)胞DNA的RT-PCR徹底被EMA抑制，同時(shí)又不會抑制活細(xì)胞DNA的RT-PCR擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)中選擇EMA質(zhì)量濃度1.0μg/mL為完全抑制死細(xì)胞DNA RT-PCR擴(kuò)增時(shí)EMA的最適質(zhì)量濃度。

圖4 完全抑制死菌細(xì)胞DNA擴(kuò)增的最小EMA添加量的優(yōu)化Fig.4 Optimization of minimum EMA amount to inhibit DNA amplification completely from heat killed cells

2.5 RT-PCR鑒別死活細(xì)胞混合液中的活細(xì)胞

圖5 固定量的熱致死細(xì)胞與變化量的活細(xì)胞混合液中DNA的不同RT-PCR擴(kuò)增Fig.5 Differential DNA amplification by RT-PCR in the mixtures of a constant number of heat-killed cells and a varying number of viable cells

由圖5可知，當(dāng)EMA質(zhì)量濃度為1.0μg/mL時(shí)，在固定量的熱致死細(xì)胞(105CFU)與變化數(shù)量的活細(xì)胞(105、104、103、102、10CFU和1CFU)混合液中，熱致死細(xì)胞的DNA的RT-PCT擴(kuò)增被完全抑制。而活細(xì)胞DNA的RT-PCR沒有受到影響，隨著細(xì)胞數(shù)量的增大，Ct值逐漸減小。對照樣品含105個(gè)熱致死細(xì)胞，不經(jīng)EMA處理，其Ct值(17.25±0.72)與不經(jīng)EMA處理且含相同活細(xì)胞數(shù)樣品的Ct值(17.34±1.01)幾乎相同。

而在固定量的活細(xì)胞(105CFU)與變化數(shù)量的熱致死細(xì)胞(105、104、103、102、10CFU 和 1CFU)混合液 DNA的RT-PCR擴(kuò)增中，各樣品的Ct值沒有統(tǒng)計(jì)顯著差異性(P＞0.05)。這是由于EMA完全抑制了熱致死細(xì)胞DNA的RT-PCR擴(kuò)增，而對活細(xì)胞DNA的RT-PCR擴(kuò)增沒有影響。其Ct值與相同活細(xì)胞濃度下不經(jīng)EMA處理的對照樣品幾乎相同(圖6)。

圖6 固定量的活細(xì)胞與變化量的熱致死細(xì)胞混合液中DNA的不同RT-PCR擴(kuò)增Fig.6 Differential DNA amplification by RT-PCR in the mixtures of a constant number of viable cells and a varying number of heat-killed cells

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 純培養(yǎng)和人工污染牡蠣樣品的Ct值與菌落數(shù)關(guān)系Table 1 The relationship between CFU and Ct values in pure culture and artificially contaminated oyster samples

添加不同的活細(xì)胞數(shù)做人工污染，純培養(yǎng)和人工污染牡蠣樣品各Ct值以及RT-PCR陽性信號率如表1所示。由表可知，隨著人工污染細(xì)胞數(shù)的不斷增大(2～2×107CFU)，純培養(yǎng)(30.65±0.56～16.52±0.44)和牡蠣樣品(30.36±0.34～19.12±0.47)的Ct值逐漸減小。并且，相同的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行人工污染，牡蠣樣品的Ct值比純培養(yǎng)要高1～3個(gè)循環(huán)。根據(jù)RT-PCR的陽性信號率，該方法對于純培養(yǎng)和人工污染牡蠣樣品的RT-PCR檢測限均為2×103個(gè)活細(xì)胞，人工污染牡蠣樣品檢測限可以達(dá)到400個(gè)細(xì)胞/克牡蠣樣品。由圖7可知，在2×103～2×107個(gè)細(xì)胞范圍內(nèi)，純培養(yǎng)和人工污染牡蠣樣品的Ct值與細(xì)胞數(shù)的對數(shù)均具有很好的線性關(guān)系。

圖7 純培養(yǎng)和人工污染牡蠣樣品中副溶血弧菌細(xì)胞數(shù)的對數(shù)與RT-PCR反應(yīng)Ct值線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curves showing the linear relationship between Ct values and Log CFU (3.3～7.3) of V. parahaemolyticus in pure culture and artificially contaminated oyster samples

2.7 RT-PCR研究人工污染凍-融牡蠣樣品中病原性副溶血弧菌細(xì)胞存活情況

圖8 RT-PCR檢測經(jīng)凍融后每克牡蠣組織中的病原性副溶血弧菌活細(xì)胞數(shù)Fig.8 The numbers of viable cells per gram of oyster tissue as a result of freezing and thawing determined by RT-PCR

1mL副溶血弧菌菌懸液(4×108CFU/mL)人工污染5g牡蠣組織，－20℃冷凍貯存7d后，在4℃水浴1h、25℃水浴30min、37℃和55℃分別水浴5min解凍時(shí)，通過平板計(jì)數(shù)和EMA RT-PCR測得的活細(xì)胞數(shù)的對數(shù)值與對照(不經(jīng)過冷凍，約6.8)沒有顯著性變化(P＞0.05)(圖8)。然而，在70℃水浴5min解凍時(shí)，平板計(jì)數(shù)和EMA RTPCR常用對數(shù)值分別下降至4.3和4.7。這可能是由于熱對一部分細(xì)菌的破壞作用，在不完全損壞細(xì)胞膜的情況下導(dǎo)致酶失活或者核糖體的降解。95℃解凍5min時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞幾乎被完全殺死，平板計(jì)數(shù)和EMA RT-PCR都沒有檢測到活細(xì)胞的存在。

3 結(jié) 論

3.1 副溶血弧菌濃度為4×108CFU/mL時(shí)，激活和光解菌懸液中EMA的最佳曝光時(shí)間為20min，不抑制副溶血弧菌活細(xì)胞RT-PCR擴(kuò)增的最大EMA質(zhì)量濃度是2μg/mL，完全抑制副溶血弧菌死細(xì)胞RT-PCR擴(kuò)增的最小EMA濃度為1.0μg/mL。

3.2 人工污染牡蠣樣品，不經(jīng)過富集培養(yǎng)，接種細(xì)胞數(shù)的對數(shù)值與對應(yīng)人工污染樣品RT-PCR的Ct值之間具有嚴(yán)格的線性相關(guān)性，純培養(yǎng)與人工污染牡蠣樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0.9981和0.9952。純培養(yǎng)與人工污染牡蠣樣品的RT-PCR檢測限均為2×103CFU，即人工污染牡蠣樣品的RT-PCR檢測靈敏度為每克牡蠣樣品400個(gè)活細(xì)胞。

3.3 在溫度低于55℃的水浴中對冷凍海產(chǎn)品進(jìn)行解凍時(shí)，凍融過程對副溶血弧菌活細(xì)胞基本沒有影響。

[1] TYAGI A, SARAVANAN V, KARUNASAGAR I, et al. Detection of Vibrio parahaemolyticus in tropical shellfish by SYBR green real-time PCR and evaluation of three enrichment media[J]. International Journal of Food Microbiology, 2009, 129(5): 124-130.

[2] NORDSTROM J L, VICKERY M C L, BLACKSTONE G M, et al.Development of a multiplex real-time pcr assay with an internal amplification control for the detection of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus bacteria in Oysters[J]. Applied and Environental Microbiology, 2007, 73(1): 5840-5847.

[3] 金周浩, 宋達(dá)鋒, 顧青. 副溶血弧菌致病因子與耐熱直接溶血毒素的研究進(jìn)展[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2008, 27(6): 320-324.

[4] 金周浩, 宋達(dá)鋒, 顧青. 副溶血弧菌毒力基因的檢測研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2008, 8(3): 143-146.

[5] 張蔚, 孟冬梅, 潘勁草, 等. 杭州地區(qū)臨床和環(huán)境分離副溶血弧菌菌株攜帶毒力基因的特征[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2004, 6(5): 77-81.

[6] 李志峰, 聶軍, 陳義忠, 等. 一種快速檢測副溶血弧菌的PCR方法[J]. 解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2004, 22(6): 443-444.

[7] 楊文鴿, 孫翠玲, 潘云娣, 等. 水產(chǎn)品中致病微生物的快速檢測方法[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2006, 6(1): 402-406.

[8] GU W M, LEVIN R E. Quantification of viable Plesiomonas shigelloides in a mixture of viable and dead cells using ethidium bromide monoazide and conventional PCR[J]. Food Biotechnology, 2007, 21(2): 145-149.

[9] LEE J M, LEVIN R E. Use of ethidium bromide monoazide for quantification of viable and dead mixed bacterial flora from fish fillets by polymerase chain reaction[J]. Journal of Microbiological Methods, 2006,67(3): 456-462.

[10] NOGVA H, DROMTORP S, NISSEN H, et al. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and bacteria by 5′-nuclease PCR[J].Biotechniques, 2003, 34(7): 804-813.

[11] RUDI K, MOEN B, DROMTORP S, et al. Use of ethidium monoazide and PCR in combination for quantification of viable and dead cells in complex samples[J]. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(3): 1018-1024.

[12] 馮建軍, 金志娟, 劉西莉, 等. 一種DNA染料結(jié)合聚合酶鏈反應(yīng)檢測鑒別植物病原細(xì)菌死活細(xì)胞[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào), 2008, 29(5):944-948.

[13] LEE J L, LEVIN R E. Discrimination of viable and dead Vibrio vulnificus after refrigerated and frozen storage using EMA, sodium deoxycholate and real-time PCR[J]. Journal of Microbiological Methods, 2009, 79(7):184-188.

[14] LEE J L, LEVIN R E. Quantification of total viable bacteria on fish fillets by using ethidium bromide monoazide real-time polymerase chain reaction[J]. International Journal of Food Microbiology, 2007, 118(2):312-317.

[15] LEE J L, LEVIN R E. Use of ethidium bromide monoazide for quantification of viable and dead mixed bacterial flora from fish fillets by polymerase chain reaction[J]. Journal of Microbiological Methods, 2006,67(3): 456-462.

[16] WANG S, LEVIN R E. Discrimination of viable Vibrio vulnificus cells from dead cells in real-time PCR[J]. Journal of Microbiological Methods,2006, 64(9): 1-8.

[17] BLACKSTONE G M, NORDSTROM J L, VICKERY M C L, et al.Detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus in oyster enrichments by real time PCR[J]. Journal of Microbiological Methods, 2003, 53(10):149-155.

[18] NAM H M, SRINIVASAN B, GILLESPIE B E, et al. Application of SYBR green real-time PCR assay for specific detection of Salmonella spp. in dair farm environmental samples[J]. International Journal of Food Microbiology, 2005, 102(4): 161-171.

[19] 劉曉俠, 林建平, 岑沛霖. 微生物基因組DNA提取方法的比較與改進(jìn)[J]. 嘉興學(xué)院學(xué)報(bào), 2007, 19(3): 48-50.

[20] ABOLMAATY A, VU C, OLIVER J, et al. Development of a new lysis solution for releasing genomic DNA from bacterial cells for DNA amplification by polymerase chain reaction[J]. Microbios, 2000, 101(6): 181-189.

Quantification of Pathogenic Viable Cells of Vibrio parahaemolyticus in Seafood by Ethidium Bromide Monoazide Staining and Real-time Polymerase Chain Reaction

ZHU Ru-gang1,2，LU Shu-xia1,3,*，LIU Yue-ping3，ZHANG Liang3
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China；2. College of Light Industry, Liaoning University, Shenyang 110036, China；3. College of Biological Science and Techology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

A new method for selectively quantitative detection of trh-positive viable cells of Vibrio parahaemolyticus in oysters was developed using ethidium bromide monoazide (EMA) staining in combination with real-time PCR (RT-PCR, real-time polymerase chain reaction). The results showed the optimum light exposure time to achieve DNA crosslinking by EMA in dead cells and to photolyze the free EMA in solution was 20 min. The use of 2.0μg/mL EMA or less did not inhibit the RT-PCR amplification of DNA derived from viable cells of Vibrio parahaemolyticus. The minimum amount of EMA to completely inhibit the RT-PCR amplification of DNA derived from heat-killed cells was 1.0μg/mL. In artificial contaminated oyster samples without enrichment process, there was a strict negative correlation between the log cell number and the Ct values in the range of 2.0 × 103to 2.0 × 107CFU. The detection limit of the real-time PCR assay was 2 × 103CFU in both pure cultures and artificial contaminated oyster samples, which indicated the sensitivity of RT-PCR was 400 CFU/g in artificial contaminated oyster sample. The freezing/thawing experiments showed thawing in water bath at temperature below 55 ℃had little effect on viable cells of Vibrio parahaemolyticus. Therefore, this method avoided the defection in traditional PCR,which could not distinguish viable bacteria cells from dead ones. It may offer a fast, sensitive method to identify andquantify pathogenic viable cells effectively.

EMA；RT-PCR (real-time polymerase chain reaction)；seafood；Vibrio parahaemolyticus；viable cells

2010-05-26

教育部留學(xué)回國人員基金項(xiàng)目(2006331)；遼寧省科技廳項(xiàng)目(20062109)；沈陽市科技局項(xiàng)目(1063312-1-00；090009)

祝儒剛(1980—)，男，講師，博士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c分子生物學(xué)。E-mail：zrg_luck@163.com

*通信作者：呂淑霞(1963—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锷锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：lushuxia@hotmail.com

TS201.6

A

1002-6630(2011)08-0219-07