程雅芳，李全文，續(xù) 穎，楊 洋，李鵬婧，韋小英

(廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004)

花生莖中白藜蘆醇的提取及體外抗氧化性的研究

程雅芳，李全文，續(xù) 穎，楊 洋*，李鵬婧，韋小英

(廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004)

探討了花生莖中白藜蘆醇的提取工藝。通過(guò)運(yùn)用4種不同體系的抗氧化性能測(cè)試方法，研究花生莖中白藜蘆醇體外清除羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基的能力和還原能力，并將其與常用的維生素C和BHT抗氧劑的抗氧化性能進(jìn)行比較。結(jié)果表明，提取花生莖中白藜蘆醇的最佳條件為:乙醇濃度為80%，料液比為1∶20，在50℃條件下浸泡2h，得到的粗提物的得率為0.083%?；ㄉo白藜蘆醇具有較強(qiáng)的抗氧化作用，所含的白藜蘆醇是其發(fā)揮作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

花生莖，白藜蘆醇，提取，抗氧化性

白藜蘆醇(Resveratrol，簡(jiǎn)稱Res)，別名虎杖甙元，分子式為 C14H12O3，化學(xué)名稱為(E)－5－［2－(4－羥苯基)－乙烯基］－1，3－苯二酚;3，4'，5－三羥基芪(3，4'，5－trihydrolystil－bene)。目前已經(jīng)在 21 個(gè)科、31個(gè)屬的72種植物中發(fā)現(xiàn)了白藜蘆醇，其中，虎杖、葡萄和花生中白藜蘆醇含量較高［1－2］。花生(A rachishy pog aea L.)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，年產(chǎn)量已達(dá)1500萬(wàn)t，其中30%左右直接和間接用于食用，每年作為食用花生出口有35～45萬(wàn)t，占總產(chǎn)量的5%左右。花生食品安全和功能食品的開(kāi)發(fā)生產(chǎn)是提高人民健康水平、延長(zhǎng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)鏈條、提高花生產(chǎn)品附加值的重要方面。其根莖含有一種芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物白藜蘆醇［(Resveratro1)3，4，5－三羥基二苯乙烯］，屬于單寧質(zhì)多酚 。白藜蘆醇具有抗氧化、清除自由基、防止老化、抗腫瘤、保護(hù)心血管和植物雌激素的作用及保肝的功效，是一種極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的天然物質(zhì)［3－4］。目前，世界上有十余個(gè)國(guó)家和地區(qū)在開(kāi)發(fā)白藜蘆醇原料及制劑，被喻為繼紫杉醇之后的又一新的綠色抗癌藥物，被人們廣泛關(guān)注。利用我國(guó)豐富的原料資源花生的副產(chǎn)物，開(kāi)發(fā)相關(guān)的保健產(chǎn)品原料資源，具有廣闊的市場(chǎng)前景及良好的經(jīng)濟(jì)效益，為花生莖白藜蘆醇提取物進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品 純度98%，天津尖峰天然產(chǎn)物有限公司;花生莖提取物 實(shí)驗(yàn)室自制;二丁基羥基甲苯(BHT)、維生素C(VC) 食品級(jí);乙醇、甲醇、丙酮、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、鄰苯三酚、三羥甲基胺基甲烷(Tris)、濃鹽酸、氫氧化鈉、三氯乙酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵等其他試劑 均為分析純。

電熱鼓風(fēng)干燥器 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司;PL2002電子天平 梅特勒－托利多儀器有限公司;SB－5200D超聲波清洗機(jī) 寧波新芝科技股份有限公司;UV1700型分光光度計(jì) 島津(Shimadzu)公司;藥物粉碎機(jī) 青島鼎龍科學(xué)儀器設(shè)備有限責(zé)任公司;酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花生莖白藜蘆醇提取物的制備［3－6］在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計(jì)研究花生莖中白藜蘆醇的提取工藝條件，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案L9(34)

1.2.2 花生莖中白藜蘆醇的測(cè)定方法 準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品5mg，用無(wú)水甲醇溶解后移入100m L容量瓶中，無(wú)水甲醇定容至刻度，搖勻，得到濃度為50μg/m L標(biāo)準(zhǔn)液備用。

取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品適量，加入10m L比色管中，使用紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行吸收光譜掃描，掃描范圍為200～600nm，確定最大吸收波長(zhǎng)。

分別精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)液 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0m L置于10m L比色管中，加無(wú)水甲醇至刻度，搖勻，分光光度計(jì)于波長(zhǎng)305nm處，以試劑空白為參比，依次測(cè)定各管的吸光度值。

1.2.3 測(cè)定總還原力［7－8］分別準(zhǔn)確量取2.0m L不同濃度的樣品液、VC、BHT，加入2.0m L pH=6.6的磷酸鹽緩沖液中，1%的鐵氰化鉀溶液2.0m L，混合物在50℃恒溫20m in后，再加入2.0m L 10%的三氯乙酸溶液，然后以3000 r/m in離心分離10m in，取上層清液5m L，加蒸餾水 4m L，0.1%FeCl3溶液 1m L，混合10m in后，以蒸餾水做參比，于700nm處測(cè)定吸光度，吸光度越高，還原能力越強(qiáng)。

1.2.4 清除羥自由基的能力 采用水楊酸法，分別加入9mmol/L的FeSO4溶液2m L，不同濃度提取液、BHT、VC各 2m L，9mmol/L 的水楊酸溶液 2m L，最后加入8.8mmol/L的 H2O2溶液2m L啟動(dòng)反應(yīng)，搖勻，靜置30min后，以蒸餾水為參比，于510nm處測(cè)定各反應(yīng)體系的吸光度;同時(shí)用水代替雙氧水，測(cè)得本底吸收吸光度AX0。根據(jù)下式計(jì)算試樣液的清除率:

IC50表示清除率為50%時(shí)體系中的供試物濃度，即半數(shù)清除濃度。以清除率為縱坐標(biāo)，各供試物濃度為橫坐標(biāo)，建立回歸方程，計(jì)算 IC50，并將 VC和BHT分別配制成不同濃度的溶液，按上述方法測(cè)定吸光度，計(jì)算清除率和IC50。

1.2.5 清除超氧自由基的能力 將4.5m L 0.05mol/L的Tris－HCl(pH8.2)，加入1.0m L不同濃度的提取液，3.2m L蒸餾水，于25℃水浴中預(yù)熱20m in后，加入0.3m L 3mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻后，在波長(zhǎng)325nm處，立即測(cè)定反應(yīng)體系的吸光度Ai;空白管以10mmol/L HCl代替鄰苯三酚，作為對(duì)照。以吸光度值A(chǔ)對(duì)反應(yīng)時(shí)間t作線性關(guān)系圖，求出斜率為Ai，清除率按下式計(jì)算:

1.2.6 清除DPPH自由基的能力 分別在4.00m L DPPH·溶液中加入0.2m L不同種類的溶液，混勻放置30m in后，用1cm比色皿于517nm處測(cè)定吸光度，即為Ai，同時(shí)在4.00m L DPPH·溶液中加入0.2m L溶劑，同樣條件下測(cè)定吸光度，即為A0;用4.00m L溶劑取代DPPH溶液所得吸光值即為Aj，按下式計(jì)算DPPH·清除率(Y):

2 結(jié)果與分析

2.1 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化花生莖白藜蘆醇的提取工藝參數(shù)

以花生莖為原料，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化提取工藝，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果、方差分析見(jiàn)表2和表3。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，影響因素的大小順序?yàn)锳＞B＞D＞C，乙醇濃度是最主要因素，其次是料液比和提取溫度，最后是時(shí)間;最佳提取條件為:A3B3C3D1。為驗(yàn)證正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)化條件，取花生莖原料3.0000g，即按照1∶20的料液比加入濃度為80%的乙醇60m L，在50℃下提取2h，白藜蘆醇的得率為0.083%，是本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的最高值。經(jīng)冷凍干燥后得到粗提物，通過(guò)靜態(tài)吸附、解吸實(shí)驗(yàn)篩選出NKA－9大孔樹(shù)脂作為層析柱填料，通過(guò)單因素優(yōu)化了白藜蘆醇的富集、分離條件。其吸附最佳條件為:上柱液流速1m L/m in，白藜蘆醇濃度為0.2mg/m L;解吸最適條件為:流速1.5m L/m in;用不同濃度的乙醇溶液梯度洗脫，合并相同組分，經(jīng)濃縮、冷凍干燥制得純度較高的白藜蘆醇純化物。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 A305nm的方差分析

2.2 總還原力的測(cè)定

從圖1可以看出，經(jīng)過(guò)純化之后的花生莖白藜蘆醇提取物具有較高還原能力，而且和濃度呈線性關(guān)系，比同濃度的VC和BHT均高。因此也可以證明，白藜蘆醇具有較高的還原能力。

圖1 還原力的測(cè)定結(jié)果

2.2 清除羥自由基能力的實(shí)驗(yàn)

由圖2可以看出，花生莖白藜蘆醇提取物對(duì)羥自由基的清除效果是非常顯著的，明顯優(yōu)于VC和BHT。雖然花生莖純化物在最初時(shí)的清除率稍低于BHT，但隨著濃度的增加，花生莖白藜蘆醇純化物的清除率明顯增加，因此在濃度達(dá)到100μg/m L時(shí)，清除率已經(jīng)優(yōu)于BHT。表4顯示，四種樣品中，白藜蘆醇純化物的IC50最低，接下來(lái)依次是BHT、粗提物、VC，表明純化物對(duì)羥基的清除效果最佳，說(shuō)明白藜蘆醇對(duì)羥基有較強(qiáng)的清除抑制作用。

表4 白藜蘆醇對(duì)羥自由基的半數(shù)抑制濃度

圖2 白藜蘆醇對(duì)羥自由基的清除效果

2.3 清除超氧陰離子自由基能力的實(shí)驗(yàn)

從圖3可以看出，花生莖的提取物具有一定的清除超氧陰離子自由基的能力，花生莖的純化物的清除效果可以和同等濃度的抗氧化劑VC相媲美，并且明顯優(yōu)于BHT。這說(shuō)明花生莖提取物具有很好的抗氧化效果。由表5可以看出，白藜蘆醇的純化物的半數(shù)抑制濃度最低，與同濃度的常見(jiàn)的抗氧化劑VC、BHT相比，效果都要好。

表5 白藜蘆醇對(duì)超氧陰離子自由基的半數(shù)抑制濃度

圖3 白藜蘆醇對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

2.4 清除DPPH自由基能力的實(shí)驗(yàn)

圖4結(jié)果顯示，隨著反應(yīng)液中白藜蘆醇濃度的增大，對(duì)DPPH自由基的清除率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)濃度為200μg/m L的時(shí)候，清除率達(dá)到了90%左右。提取液在白藜蘆醇濃度較低的情況下也表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除效果，50μg/m L時(shí)清除率也可達(dá)到41%，可見(jiàn)白藜蘆醇對(duì)DPPH自由基有良好的清除效果。由表6可以看出，白藜蘆醇純化物對(duì)DPPH的半數(shù)抑制濃度僅為74.394μg/m L，比其他的都要低很多，也就證明了它的清除效果是最佳的。

表6 白藜蘆醇對(duì)DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度

圖4 白藜蘆醇對(duì)DPPH·的清除效果

3 結(jié)論

3.1 確定了提取花生莖中白藜蘆醇的最佳條件為:乙醇濃度為80%，料液比為1∶20，在50℃條件下浸泡2h，得到的粗提物的得率為0.083%。

3.2 花生莖中白藜蘆醇的還原能力略高于VC，但明顯優(yōu)于BHT?；ㄉo中白藜蘆醇無(wú)論是粗提物還是經(jīng)過(guò)純化的提取物對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基都具有較高的清除抑制效果，而且濃度越高，清除效果越好。

3.3 純化得到的花生莖白藜蘆醇樣品在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度分別為:50.260、64.080、74.394μg/m L。

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Study on extraction and antioxidant ability of resveratrol from peanut stem

CHENG Ya－fang，LIQuan－wen，XU Ying，YANG Yang*，LI Peng－jing，WEI Xiao－ying
(College of Life Science And Technology，Guangxi University，Nanning 530004，China)

The technology of extracting resveratrol from the stem of peanuts was investigated.With test methods of four different systems of antioxidation ability，the scavenging activities of resveratrol from peanut stem on hydroxyl free－radical(·OH)，superoxide anion free－radical(O2－·)，DPPH free－radical(DPPH·)and deoxidating activity were studied and compared with the VCand BHT by spec trophotometry.The results showed that resveratrol in peanut stem was a natural antioxidation and had strong antioxidant capacity which might result from the resveratrol in it.The optimum extraction conditions were as follows:the rate of solid to solution is was 1∶20，the concentration of ethanol was 80%，the temperature was 50℃，abstraction time was 2h.Under the optimized condition，the yields of resveratrol were 0.083%.

peanut stem;resveratrol;extracting;antioxidation

TS255.6

A

1002－0306(2011)07－0144－03

2010－06－12 *通訊聯(lián)系人

程雅芳(1984－)，女，在讀碩士，研究方向:生物制藥研究。