周華生，張連龍，戴舒春，成恒嵩

(無(wú)錫健特藥業(yè)有限公司，江蘇無(wú)錫 214091)

鉬藍(lán)比色法測(cè)定保健食品中微量硒

周華生，張連龍，戴舒春，成恒嵩

(無(wú)錫健特藥業(yè)有限公司，江蘇無(wú)錫 214091)

建立了鉬藍(lán)比色法測(cè)定保健食品中微量硒的新方法。該方法最大吸收波長(zhǎng)760nm，在0～100ng/mL濃度范圍內(nèi)濃度與吸光度呈線性關(guān)系，回歸方程y=－4.142+133.2x，相關(guān)系數(shù)r=0.9991，最低檢測(cè)量1ng/mL，重復(fù)性好，RSD=3.17%，回收率95.98%～105.00%。該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，適合不同補(bǔ)硒類保健食品中的硒含量測(cè)定，該方法的建立有利于這類產(chǎn)品質(zhì)量控制和提高。

保健食品，鉬藍(lán)比色法，硒，測(cè)定

硒是人體必需的微量元素之一，它在人體內(nèi)具有清除活性氧自由基、抗腫瘤、抗輻射、防治心腦血管疾病和增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等功能［1］。由于硒在人體內(nèi)適宜濃度范圍較窄，每天攝入量的多寡，對(duì)人體健康影響較大，過少達(dá)不到補(bǔ)硒的應(yīng)有作用，過多會(huì)引起慢性中毒［2］。1976年國(guó)際硒營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦每天攝入標(biāo)準(zhǔn)為60μg，1988年中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦日采攝標(biāo)準(zhǔn)為50μg。目前國(guó)家規(guī)定藥用亞硒酸鈉原料中硒含量測(cè)定采用硫代硫酸鈉滴定法［3］，食品中硒含量則用氫化物原子熒光光譜法和熒光法測(cè)定［4］，這些都是經(jīng)典的方法。但藥物的化學(xué)滴定法僅用于純品原料，不適合保健食品中硒的測(cè)定。食品中硒的2種測(cè)定方法則需要昂貴的儀器，操作步驟繁瑣，尤其是熒光 法 要 使 用 2，3－二 氨 基 萘 (2，3－Diaminonaphthalene，DAN)，熒光試劑毒性較大，而鉬藍(lán)比色法簡(jiǎn)便、快捷、靈敏、準(zhǔn)確，適合保健食品中微量硒的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

兒童及青少年型多種維生素咀嚼片、女士型和中老年型多種維生素片、靈硒康口服液 本公司生產(chǎn);富硒康口服液 華信生物藥業(yè)股份有限公司;富硒膠囊 天獅生物工程有限公司;善存佳維片 惠氏制藥有限公司;酵母硒膠囊 安琪酵母股份有限公司;益美膠囊 娃哈哈集團(tuán)有限公司;奧硒康膠囊 天賜福生物醫(yī)藥有限公司，市場(chǎng)收集購(gòu)買;硝酸、高氯酸、鹽酸、硫酸 優(yōu)級(jí)純;次磷酸鈉、磷鉬酸、氯化汞、乙二胺四乙酸二鈉、三乙醇胺、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、氨水 分析純;水 去離子水;硒標(biāo)準(zhǔn)溶液 100μg/m L，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院提供，精密吸取該溶液0.50m L，用0.1mol/L鹽酸溶液稀釋至100m L，此溶液為0.5μg/m L硒標(biāo)準(zhǔn)使用液。

UV－2450型紫外可見分光光度計(jì)、AA－6800型原子熒光分光光度計(jì) 日本島津;F－4500型熒光分光光度計(jì) 日本日立;AE－240型分析天平Mettler;pHs－3型精密數(shù)顯酸度計(jì) 上海天達(dá)儀器有限公司;HH－S2S型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市大地自動(dòng)化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取0.5μg/m L硒標(biāo)準(zhǔn)使用液 0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00m L 分別置于 25m L 容量瓶中，相當(dāng)于 0、10、20、40、60、80、100ng/m L 硒，各加1∶1 鹽酸溶液5m L，50μg/m L 氯化汞溶液2.5m L，1%次磷酸鈉溶液2.5m L，0.01mol/L的磷鉬酸溶液2.5m L，1∶1磷酸溶液0.5m L，用水定容至刻度，搖勻，將容量瓶置55℃恒溫水浴鍋25m in后取出，此時(shí)溶液呈藍(lán)綠色，冷卻至室溫，在可見光譜600～900nm連續(xù)掃描，確定測(cè)定波長(zhǎng)。

表1 顯色體系的穩(wěn)定性

1.2.2 反應(yīng)條件 在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，標(biāo)準(zhǔn)品濃度60ng/m L 條件下，反應(yīng)溫度為 51、53、55、57、59℃;反應(yīng)時(shí)間為21、23、25、29、31m in;反應(yīng)酸度，其中1∶1 的鹽酸溶液為 1、3、5、7、9m L，1% 次磷酸鈉溶液為 1、1.5、2.5、3.5、4.5m L，0.01mol/L 的磷鉬酸溶液為 1、1.5、2.5、3.5、4.5m L，1∶1 磷酸溶液為 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9m L，做各個(gè)反應(yīng)條件的單因素實(shí)驗(yàn)，測(cè)定顯色液的吸光度。

1.2.3 樣品消化 固體樣品:用研缽碾成細(xì)粉，視樣品含硒量高低精確稱取約0.5g;液體樣品:搖勻精密吸取約2m L，于消化管內(nèi)加混合酸(硝酸∶高氯酸=3∶1)12m L，放在消化爐上加熱，保持微沸，持續(xù)加熱至冒白煙，冷卻后無(wú)色透明，此時(shí)加入10m L 1∶9鹽酸溶液，繼續(xù)加熱至剩余體積約2m L，切忌燒干，冷卻后用水轉(zhuǎn)移至50m L容量瓶中，定容，搖勻待用，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 樣品測(cè)定 精密吸取消化液10m L，于25m L容量瓶中按標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣操作，顯色，測(cè)定吸光度。

式中，C－由回歸方程求出樣品中硒含量，ng;V1－樣品消化液吸取量，m L;V2－樣品消化液總體積，m L;m－樣品的質(zhì)量，g或m L。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)

標(biāo)準(zhǔn)品和樣品按測(cè)定方法顯色，在可見光譜600～900nm連續(xù)掃描。由圖1可見，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品最大吸收峰為760nm。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的光譜圖

2.2 反應(yīng)溫度、時(shí)間和酸度的最佳條件

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在一定的標(biāo)準(zhǔn)品濃度條件下，隨著溫度的升高，吸光度增大，高于57℃后，吸光度有所降低，故選擇55℃為最佳反應(yīng)溫度。同樣選擇反應(yīng)時(shí)間25m in，1∶1的鹽酸溶液用量5m L，1%次磷酸鈉溶液用量2.5m L，0.01mol/L的磷鉬酸溶液用量2.5m L，1∶1 磷酸溶液用量 0.5m L。

2.3 線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和最低檢測(cè)限

當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品硒濃度為0、10、20、40、60、80、100ng/m L時(shí)，對(duì)應(yīng)的吸光度分別為 0.00、0.064、0.105、0.184、0.335、0.489、0.624，在 0～100ng/m L 濃度范圍內(nèi)呈直線回歸，回歸方程y=－4.142+133.2x，相關(guān)系數(shù)r=0.9991，最低檢測(cè)限按GB/T5009.1－2003的方法確定為1ng/m L。

2.4 方法穩(wěn)定性

標(biāo)準(zhǔn)品和處理后的樣品按測(cè)定方法顯色，放置一定時(shí)間后測(cè)定，顯色液在2h內(nèi)吸光度保持不變，穩(wěn)定性較好。結(jié)果見表1。

2.5 主要共存離子的影響與消除

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)某些含多種維生素和礦物質(zhì)的保健食品，消化后有機(jī)部分被消除，而無(wú)機(jī)的礦物質(zhì)被留在消化液中。在所測(cè)的保健食品中，涉及的無(wú)機(jī)離子有 Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Cr3+、Fe2+等，其測(cè)定時(shí)最高含量分別為Ca2+1mg/m L、Mg2+0.5mg/m L、Zn2+20μg/m L、Cu2+5μg/m L、Mn2+10μg/m L、Cr3+100ng/m L，再加入標(biāo)準(zhǔn)Se4+80ng/m L，吸光度分別為0.482、0.487、0.478、0.491、0.479、0.492，與未加上述離子時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定結(jié)果一致，說(shuō)明對(duì)測(cè)定結(jié)果均無(wú)影響，而Fe2+影響較大，當(dāng)Fe2+≤0.2μg/m L對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響，隨著濃度增高，顏色逐漸變淺，吸光度降低，當(dāng)Fe2+≥10μg/m L時(shí)則不顯色(表2)。表2為在80ng/m L標(biāo)準(zhǔn)品濃度下，加不同濃度Fe2+后的測(cè)定結(jié)果。

為了消除Fe2+的干擾，實(shí)驗(yàn)選用多種掩蔽劑，取得明顯效果的有以下幾種:a.樣品消化后轉(zhuǎn)移過程中，加入2m L 2mol/L EDTANa2，用 1∶1 氨水調(diào) pH1.5～2.0，定容后測(cè)定。b.樣品消化后轉(zhuǎn)移過程中，加入10m L 20%酒石酸鉀鈉，用4mol/L氫氧化鈉調(diào)至黃色沉淀，定容靜置后吸取上清液測(cè)定。c.樣品消化轉(zhuǎn)移過程中，加入2m L 1∶1三乙醇胺定容后測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)證明，加入上述3種掩蔽劑的任何1種都可以消除Fe2+干擾，進(jìn)行鉬藍(lán)比色法測(cè)定(表3)，這是因?yàn)檫@些掩蔽劑與Fe2+形成絡(luò)合物，抑制了Fe2+活度［5］，使鉬藍(lán)顯色正常進(jìn)行。

表3 掩蔽劑的效果

表2 Fe2+干擾的測(cè)定

表4 精密度測(cè)定

表6 不同保健食品硒含量測(cè)定

2.6 精密度測(cè)定

實(shí)驗(yàn)選用中老年型維生素保健食品，精確稱取6份樣品按測(cè)定方法消化，加入掩蔽劑顯色后測(cè)定吸光度，計(jì)算硒含量，結(jié)果見表4。由表4可知，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好，RSD=3.17%，精密度較高。

2.7 回收率測(cè)定

試液選用靈硒康保健食品，按測(cè)定方法消化、制備3種不同濃度的樣品本底，分別加入3種不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，每種濃度重復(fù)3次，共9個(gè)樣本分別測(cè)定回收率，結(jié)果見表5。在線性范圍內(nèi)，“低”、“中”、“高”濃度樣品的回收率均很好，回收率為95.98%～105.00%，符合定量測(cè)定要求。

2.8 不同保健食品硒含量測(cè)定

不同類型補(bǔ)硒類保健食品分別用鉬藍(lán)法及食品中硒含量測(cè)定2種國(guó)標(biāo)法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果均相吻合，結(jié)果見表6。其中鉬藍(lán)法與熒光法接近程度優(yōu)于氫化原子熒光法，鉬藍(lán)法與熒光法相對(duì)誤差為3.14%～4.79%，而與氫化原子熒光法相對(duì)誤差為2.39%～11.54%。這說(shuō)明鉬藍(lán)法和熒光法比原子熒光法相對(duì)穩(wěn)定，而且鉬藍(lán)法儀器簡(jiǎn)單，即普通的分光光度計(jì)就可以測(cè)定，其靈敏度高，檢測(cè)限低，操作便捷，符合保健食品中硒測(cè)定要求。

表5 回收率測(cè)定

3 討論

3.1 鉬藍(lán)比色法是在酸性介質(zhì)中，還原劑將磷鉬雜多酸還原為鉬藍(lán)，其顏色深淺與硒含量成正比。本研究以鹽酸為介質(zhì)，次磷酸鈉為還原劑，Se4+為催化劑，催化次磷酸鈉的還原性，氯化汞為顯色穩(wěn)定劑。要完成此反應(yīng)，必須使 Se6+轉(zhuǎn)化為Se4+，反應(yīng)式如下:Se6++HCl→Se4+，H3PO4+H3Mo12O40P·2H2O(磷鉬酸)→PMo12O40(磷鉬雜多酸)，PMo12O40+NaH2PO2·H2O(次磷酸鈉)+Se4+→H3PO410MoO3(鉬藍(lán))。但多種維生素片和善存佳維片添加大量的Fe2+阻止了Se4+的催化作用，只有加掩蔽劑，抑制Fe2+的活度，才生成鉬藍(lán)。而對(duì)未加入Fe2+的保健食品，如靈硒康、富硒康、酵母硒膠囊等，則無(wú)需加入掩蔽劑，便可直接進(jìn)行測(cè)定。

3.2 國(guó)內(nèi)外用比色法測(cè)定微量硒(ng級(jí))的方法較多，如酸性鉻藍(lán)K催化褪色法測(cè)定人發(fā)、茶葉和肉類產(chǎn)品中的硒［6］，碘化鉀－結(jié)晶紫法測(cè)定井水中的硒［7］，碘化鉀－孔雀石綠測(cè)定礦泉水、自來(lái)水中的硒［8］，以及醋酸氨基乙烯亞鐵銨催化分光光度法測(cè)定天然水中的硒［9］，這些方法由于空白值本底較高，標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度吸光度差異不明顯，線性范圍較窄，靈敏度低，測(cè)定對(duì)象成分較單一，嘗試后均不適合成分復(fù)雜的保健食品硒的測(cè)定。

3.3 鉬藍(lán)比色法只需要嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度、時(shí)間、酸度等條件，其線性范圍寬、靈敏度高、檢測(cè)限低，為1ng/m L，而熒光法為0.5ng/mL，氫化原子熒光法為3ng/m L，可與國(guó)標(biāo)的2種方法相媲美。但是鉬藍(lán)比色法簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)，適合于多種補(bǔ)硒類保健食品中微量硒的測(cè)定，值得廣泛運(yùn)用和推廣。

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Colorimetric determination of trace amounts of selenium with molybdenum blue in health foods

ZHOU Hua－sheng，ZHANG Lian－long，DAI Shu－chun，CHENG Heng－song

(Wuxi Gaint Pharmaceutical CO.，LTD.，Wuxi214091，China)

The novelmethod was described for the colorimetric determination of micro－quantities of selenium with molybdenum blue in health food.The maximum absorbance wavelength was 760nm，the linearity range was 0～100ng/m L，regression equation was y= －4.142+133.2x，r=0.9991.The detection limit，repeatability(RSD)and recovery were 1ng/m L，3.17%and 95.98%～105.00%respectively.The method was simple，rap id，sensitive，accurate，and was suitable to assay selenium in varied riching－selenium health food.This established analytical method provided a useful way in quality control and improvement in this type of food.

health food;molybdenum blue spec trophotometry;selenium;determination

TS207.5+1

A

1002－0306(2011)08－0412－04

2010－05－10

周華生(1977－)，男，主管藥師，從事藥品和保健食品質(zhì)量檢測(cè)和分析方法的研究。