諶素華，王維民，劉 輝，李春蓮

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524025)

亨氏馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯提取工藝的研究

諶素華，王維民*，劉 輝，李春蓮

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524025)

從亨氏馬尾藻中提取巖藻聚糖硫酸酯(SPF)，采用超聲波輔助水提法，以多糖提取率為指標(biāo)，利用Statistica軟件分析多糖提取率與各因素的相關(guān)性，再通過響應(yīng)面法的中心組合設(shè)計優(yōu)化SPF的工藝參數(shù)。建立了多糖提取率與超聲時間、提取溫度和提取時間之間的二次回歸模型，即:Y=10.40+0.52A－0.047B+0.32C－0.28AB+0.13AC－0.12BC－0.52 A2－0.13B2－0.46C2。優(yōu)化后的最佳提取條件為:提取 pH6.00，提取溫度80℃，提取料液比1∶30，提取時間3.57h，超聲時間48.5min，超聲功率350W。SPF得率可達10.32%，SPF中總多糖含量為36.65%，巖藻糖含量為7.35%，硫酸根含量為13.60%。

亨氏馬尾藻，巖藻聚糖硫酸酯，響應(yīng)面法，超聲波，提取

亨氏馬尾藻(Sargassum henslowianum C.Agardh)隸屬褐藻門，墨角藻目，馬尾藻科，馬尾藻屬。藻體黑褐色，較粗糙，高約 1m，固著器盤狀，直徑約1～1.5cm，其上長出一個或兩個主干，主干較短，圓柱狀。亨氏馬尾藻生長在低潮帶巖石上，在香港、汕頭、上川島、硇洲島、福建省的浦田和平譚等均有分布［1］。馬尾藻主要產(chǎn)于廣東和海南等沿海地區(qū)，是一種褐藻類海洋植物，資源相當(dāng)豐富，大部分在近海岸天然生長，易獲得。海藻中含有豐富的多糖，海藻多糖是海藻中重要的生物活性物質(zhì)［2］，巖藻聚糖硫酸酯(Sulfated fucan)又稱為褐藻糖膠(Fucoidan)、巖藻聚糖，是存在于所有褐藻中的一種水溶性雜多糖，其主要成分除了L－巖藻糖和硫酸根外，還含有半乳糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)等。越來越多的研究表明，褐藻糖膠具有廣泛的生理活性，如具有抗病毒、抗凝血、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、調(diào)節(jié)免疫等作用［3－4］，其活性與硫酸根含量和位置密切相關(guān)。本文采用Statistica軟件分析多糖提取率與各因素的相關(guān)性，挑選出顯著相關(guān)因素，再通過響應(yīng)面法采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計的工具，從而得出其較合理的設(shè)計和優(yōu)良的工藝參數(shù)，旨在為馬尾藻的綜合利用提供一定的科學(xué)理論根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

亨氏馬尾藻 采于廣東湛江硇洲島，經(jīng)淡水清洗，曬干粉碎過篩(80目)，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

AUW 120型電子分析天平 日本島津;高速冷凍離心機 日本日立;722S分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;PHS－3C精密pH計 上海雷磁儀器廠;LGJ－10冷凍離心機 北京四環(huán)儀器廠。

表2 兩水平實驗結(jié)果

1.2 實驗方法

1.2.1 粗巖藻聚糖硫酸酯的提取 稱取一定量的藻粉，按照以下各種條件:提取 pH(1～7)、提取溫度(60～100℃)、提取料液比(1∶20～1∶60)、提取時間(2～6h)、超聲時間(20～50m in)、超聲功率(300～450W)。加入水混勻提取，抽濾，取上清液濃縮，加入無水乙醇至最終濃度30%，離心除去水溶性褐藻膠，取上清液。再加入乙醇至最終濃度80%，離心取沉淀，沉淀用無水乙醇、丙酮洗滌，烘干后得粗SPF并測定多糖含量。

1.2.2 多糖含量測定 采用苯酚硫酸法［5］。標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:以巖藻糖－半乳糖(2.5∶1)為標(biāo)準(zhǔn)糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品含量測定:稱取一定量的SPF加水定容成0.5mg/m L溶液，取1m L溶液按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法測定多糖含量，得回歸方程:y=0.0126x+0.0086，R2=0.9981。

1.2.3 硫酸基的Dodgson法定量測定［6］標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:以硫酸鉀為標(biāo)準(zhǔn)品配成鹽酸溶液。稱取一定量樣品 SPF制成 1.3mg/m L的 1mol/L HCl溶液，100℃密封加熱5h，冷卻后過濾取0.2m L按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法測定硫酸基含量。得回歸方程:y=0.0005x+0.0011，R2=0.9992。

1.2.4 巖藻糖含量測定［7］Dische比色法測定多糖中的 L－巖藻糖含量。得回歸方程:y=0.017x－0.0008，R2=0.9995。

1.2.5 實驗設(shè)計及數(shù)據(jù)處理 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，利用STATISTIC軟件實驗設(shè)計中的“Two－Level”即兩水平設(shè)計來篩選主要因素［8］。對篩選出的主要因素超聲時間、提取溫度、提取時間進行響應(yīng)面優(yōu)化，實驗以隨機次序進行，重復(fù)3次，根據(jù) Box－Benheken中心組合實驗設(shè)計原理，實驗設(shè)計因素和水平見表1。結(jié)果用Design Expert軟件進行回歸分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 各因素對亨氏馬尾藻粗巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響

用Statistic軟件兩水平設(shè)計做因素與巖藻聚糖硫酸酯得率相關(guān)度的分析，可得相關(guān)性系數(shù)，各因素的方差分析結(jié)果，見表2、表3。

表1 因素水平編碼表

從F值的大小可以直觀地看出，上述六因素中對巖藻聚糖硫酸酯得率的顯著性排列是C＞F＞B＞A＞D＞E。而通過概率分析結(jié)果可以看出，C因素影響最為顯著，E(P＜0.05)因素影響不顯著，選取料液比1∶30(g/g)，其它均顯著(P＞0.05)。由于提取過程中超聲功率隨提取率變化不大，因此將超聲功率定為350W;研究認(rèn)為在酸性條件下(pH＜3)提取巖藻聚糖硫酸酯，由此會導(dǎo)致多糖分子上硫酸基的脫落，破壞多糖的生物活性，因而選取pH為6進行巖藻聚糖硫酸酯提取。選擇C、F、B三個因素作為主要因素作進一步的響應(yīng)面分析，以確定巖藻聚糖硫酸酯提取的最優(yōu)水平。

表3 各因素的方差分析結(jié)果

2.2 亨氏馬尾藻粗巖藻聚糖硫酸酯提取工藝參數(shù)的優(yōu)化在科學(xué)研究中，為了克服正交設(shè)計或均勻設(shè)計實驗精度不夠高的缺點，采用響應(yīng)面法優(yōu)化實驗［9］。

通過上述實驗對篩選出的主要因素超聲時間、提取溫度、提取時間進行響應(yīng)面優(yōu)化，以粗巖藻聚糖硫酸酯得率為考察指標(biāo)，采用統(tǒng)計分析軟件Expert design 7.0中關(guān)于響應(yīng)面分析(RSM)的部分對實驗進行設(shè)計、分析和工藝優(yōu)化，實驗結(jié)果見表4。

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及實驗結(jié)果 以粗巖藻聚糖硫酸酯得率(Y)為響應(yīng)值，其實驗結(jié)果及方案見表4，通過RSM軟件對其進行方差分析，其結(jié)果見表5。利用Expert design 7.0軟件對表5數(shù)據(jù)進行二次回歸分析，得到回歸模型:y=10.40+0.52A－0.047B+0.32C－0.28AB+0.13AC－0.12BC－0.52A2－0.13B2－0.46C2。

表5 回歸模型方差分析表

表4 響應(yīng)面中心組合設(shè)計實驗結(jié)果

該模型表達了粗巖藻聚糖硫酸酯得率與所選3個因素之間的變化關(guān)系。一次項中的A、C，交互項中的AB，二次項中的A2、C2對實驗指標(biāo)有顯著或極顯著的影響，其余各項影響不顯著。由表5可知，模型 F 值為 22.06，F(xiàn) ＞F0.01(9，10)=4.15，模型顯著水平遠(yuǎn)小于0.05，表明二次回歸模型極顯著;并且回歸模型的F－檢驗顯示，實測值與預(yù)測值的相關(guān)系數(shù)R2=0.9521，說明模型的預(yù)測值和實驗值擬合較好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著。綜合各參數(shù)說明該實驗方法可靠，各因素水平區(qū)間設(shè)計較合理，因此可用該回歸模型預(yù)測粗巖藻聚糖硫酸酯的得率。

2.2.2 降維分析 根據(jù)回歸分析結(jié)果，在3個因素中固定一個變量(取0水平，即超聲時間48.5m in，提取溫度80℃，提取時間3.57h)進行降維分析，做出相應(yīng)的三維響應(yīng)曲面圖。由圖1～圖3可知，三維響應(yīng)曲面圖均呈拋物面開口向下的圓頂丘狀，隨著響應(yīng)值的增加而形成一個頂點，表明回歸方程在所選水平范圍內(nèi)存在極大值。而二維等高線圖都呈橢圓型，表明超聲時間、提取溫度和提取時間兩兩之間的交互作用，這與方差分析的結(jié)果一致。且當(dāng)超聲時間、提取溫度和提取時間趨近0水平時，粗巖藻聚糖硫酸酯的得率有極大值。

圖1 超聲時間、提取溫度及其交互作用對粗巖藻聚糖硫酸酯得率影響的響應(yīng)面圖

圖2 超聲時間、提取時間及其交互作用對粗巖藻聚糖硫酸酯得率影響的響應(yīng)面圖

圖3 提取溫度、提取時間及其交互作用對粗巖藻聚糖硫酸酯得率影響的響應(yīng)面圖

圖1顯示了提取時間為3h時，超聲時間和提取溫度的交互影響效應(yīng)。由圖1的響應(yīng)面及其投影的等值線圖可以看出，超聲時間和提取溫度這2個因素的交互作用較顯著［10］，粗巖藻聚糖硫酸酯的得率有極大值。圖2顯示了提取溫度90℃時，超聲時間和提取時間的交互影響效應(yīng)。響應(yīng)面近似一個倒扣的圓鍋，其投影為圓形，說明超聲時間和提取時間二因素的交互作用不顯著。但從響應(yīng)面及其投影的等值線圖可知，粗巖藻聚糖硫酸酯的得率在二因素的0～1水平之間有極大值。圖3顯示提取溫度和提取時間對粗巖藻聚糖硫酸酯的得率的交互影響效應(yīng)。提取率有極大值，但交互作用不顯著。

Expert design 7.0軟件回歸模型分析得出最佳提取方案:A=0.85，B=－1，C=0.57，即超聲時間48.5m in，提取溫度80℃，提取時間3.57h，這與降維分析和響應(yīng)面分析的結(jié)果一致。此條件下理論提取得率為10.38%。在優(yōu)化條件下進行3次平行實驗，平均提取率為10.32%。

結(jié)合Statistic軟件兩水平設(shè)計因素與巖藻聚糖硫酸酯得率相關(guān)度的分析結(jié)果，得出超聲輔助水提取巖藻聚糖硫酸酯的最優(yōu)工藝條件為:提取pH6.00，提取溫度80℃，提取料液比1∶30，提取時間3.57h，超聲時間48.5m in，超聲功率350W。

2.3 亨氏馬尾藻粗巖藻聚糖硫酸酯成分分析

見表6。

表6 亨氏馬尾藻多糖含量及組成

3 結(jié)論

利用Statistic軟件兩水平設(shè)計與Expert design 7.0軟件回歸模型分析相結(jié)合。得到二次回歸分析回歸模型:y=10.40+0.52A－0.047B+0.32C－0.28AB+0.13AC－0.12BC－0.52A2－0.13B2－0.46C2。對回歸模型進行方差分析，得出該模型能較好地反映亨氏馬尾藻巖藻多糖的提取率。對回歸模型進行優(yōu)化，得出最佳提取條件為:提取pH6.00，提取溫度80℃，提取料液比1∶30，提取時間3.57h，超聲時間48.5m in，超聲功率350W，在該條件下亨氏馬尾藻粗巖藻聚糖硫酸酯得率為10.32%。亨氏馬尾藻多糖中巖藻糖含量高達7.35%，硫酸根含量為13.60%。因此，亨氏馬尾藻可作為開發(fā)褐藻糖膠的優(yōu)質(zhì)原料。

［1］曾呈奎，陸保仁 .中國海藻志［M］.北京:科學(xué)出版社，2000.

［2］譚仁祥.功能海洋生物分子:發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用［M］.北京:科學(xué)出版社出版，2007:203，476.

［3］Ponce NmA，PujolL C A，Damonte E B，et al.Fucoidan from the brown seaweed Adeuocystis utricularise extraction method，antiviral activity and structural studies［J］.Carb Res，2003，338(2):153 －165.

［4］Varenne A，Gareil P， Colliec J S，et al.Capillary electrophoresis determination of the binding affinity of bioactive sulfated polysaccharides to proteins study of the binding properties of fucoidan to antithrombin［J］.Anal Biochem，2003，315(2):152－159.

［5］張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)［M］.第二版.杭州:浙江大學(xué)出版社，1999:11－12.

［6］張惟杰.復(fù)合多糖生化研究技術(shù)［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1987:296－297.

［7］Gibbons mN.The determination of methylpentoses［J］.Analyst，1955，80:267－276.

［8］王亦軍.STATISTICA計算機軟件在化學(xué)實驗數(shù)據(jù)分析中的應(yīng)用［J］.青島大學(xué)學(xué)報，2001，16(2):90－93.

［9］Rao K J，Kim C H，Rhee S K.Statistical optimization of medium for the production of recombinant hirudin from Saccharomyces cerevisiae using response surface methodology［J］.Process Biochemistry，2000，35(7):639－647.

［10］Muralidhar R V，Chirumamila R R，Marchant R，et a1.A response surface approach for the comparison of lipade production by Candida cyylindracea using two different carbon sources［J］.Biochemistry Engineering，2001(9):17－23.

Study on extracting process of fucoidan from Sargassum henslowianum

CHEN Su－h(huán)ua，WANG Wei－min*，LIU Hui，LI Chun－lian

(College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524025，China)

Fucoidan from Sargassum hemiphyllum was extracted by ultrasonic wave extraction method.Statistica and response surface methodology(RSM)were used to optimize the SPF parameters.The results showed that the behavior of the system was explained by the following quadratic equation between SPF and the fac tors(ultrasonic time，extraction temperature and extraction time):y=10.40+0.52A－0.047B+0.32C－0.28AB+0.13AC－0.12BC－0.52A2－0.13B2－0.46C2.SPF rate condition was extracted based on that equation:extraction time 3.57h，80℃ and ultrasonic time 48.5m in.The last optimization condition:pH6.00，temperature 80℃，the ratio of solution to algae power 1∶30，extraction time 3.57h，ultrasonic time 48.5m in，the power 350W，and the SPF extraction rate was 10.32%，polysaccharide content 36.65%，fucose content and sulfate group content were 7.35%and 13.60%.

Sargassum henslowianum;fucoidan;response surface analysis;ultrasonic;extraction

TS254.1

B

1002－0306(2011)08－0269－04

2009－12－25 *通訊聯(lián)系人

諶素華(1974－)，女，碩士研究生，實驗師，研究方向:食品加工及貯藏。

廣東海洋大學(xué)校選課題(0812089)。