劉佳佳，佘永新，劉洪斌，金茂俊，邵 華，金 芬，王 靜

(中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與食物安全重點實驗室，農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，北京 100081)

聚醚類抗生素殘留檢測技術(shù)及其研究進展

劉佳佳，佘永新，劉洪斌，金茂俊，邵 華，金 芬，王 靜*

(中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與食物安全重點實驗室，農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，北京 100081)

聚醚類抗生素是禽畜養(yǎng)殖中廣泛應用的球蟲抑制藥，對這類藥物殘留量的檢測技術(shù)研究對于控制獸藥殘留超標，保證禽畜產(chǎn)品安全有著重要的意義。綜述了近年來聚醚類抗生素的檢測方法，包括微生物法、免疫法、分光光度計法、色譜法，并詳細介紹了液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在該類藥物檢測中的應用及其前景，討論了未來聚醚類抗生素檢測技術(shù)的研究發(fā)展方向，為今后分析檢測各類樣品基質(zhì)中聚醚類抗生素的殘留提供參考和依據(jù)。

聚醚類抗生素，殘留，檢測，研究進展

自從20世紀20年代，弗萊明(A.Flem－ing)發(fā)現(xiàn)青霉素以來，各種抗生素已被廣泛用于治療人類和動物的細菌感染引起的疾病，隨著藥物種類的不斷壯大，用藥量的不斷加大，藥物濫用，不遵守休藥期，違禁藥物的使用，導致畜產(chǎn)品中獸藥殘留超標的現(xiàn)象不斷發(fā)生［1－5］。因此，世界各國都已經(jīng)對獸藥殘留實施越來越嚴格的監(jiān)管和控制，愈來愈多的獸藥檢測方法被開發(fā)應用在日常的監(jiān)測中。聚醚類抗生素是由放線菌發(fā)酵液產(chǎn)生的離子載體類抗生素。此類化合物在化學結(jié)構(gòu)上含有許多醚基和一個一元有機酸基，其中心由于有并列的氧原子而帶負電，外部主要由烴類組成，具有中性和疏水性［6］。目前主要使用的品種有莫能菌素、鹽霉素、拉沙洛菌素、馬杜霉素、甲基鹽霉素、賽杜霉素、尼日利亞菌素，由于本身不穩(wěn)定，所以聚醚類物質(zhì)多以鹽的形式保存。聚醚類抗生素用作飼料添加藥物［7］，可以增加飼料利用率，預防球蟲病。反芻動物體內(nèi)［8］，聚醚類藥物可以控制瘤胃中產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸的比例、抑制甲烷的產(chǎn)生、控制瘤胃的pH、增加過瘤胃蛋白比例、限制瘤胃原蟲的增殖從而控制瘤胃發(fā)酵提高飼料利用率和增重［9］。另外，聚醚類抗生素用作廣譜球蟲抑制類藥物比一般的抗生素的抗球蟲活性高，其作用的主要機理是:藥物分子容易與Na+、K+等離子結(jié)合生成親脂性絡(luò)合物，增加離子向球蟲細胞內(nèi)運輸，為了平衡滲透壓，大量水分進入球蟲細胞內(nèi)，導致球蟲腫脹而死亡［10］，因此也被稱為離子載體類抗球蟲藥。實驗表明，離子載體類藥物對動物心血管系統(tǒng)有明顯的影響［11－13］，具有擴張冠狀血管和增加心臟冠脈流量的作用［14］。飼養(yǎng)過程中，聚醚類抗球蟲藥物的添加量過高導致動物性食品中的藥物殘留，可能對人類身體健康產(chǎn)生危害［15－17］，尤其可能會加劇心血管患者的病情［18］，同時會造成潛在的環(huán)境污染。日本、澳大利亞、美國、歐盟、中國都先后規(guī)定了動物組織、牛奶中聚醚類抗生素的最大殘留限量(MRLs)，如表1所示［19］。隨著各國對獸藥殘留的重視，對殘留限量的

表1 中國、日本、歐盟規(guī)定的聚醚類抗生素最大殘留限量(MRLs)(μg/kg)［19］

要求越來越嚴格，部分藥物已被禁用，并要求不得檢出［20］。目前，已經(jīng)建立的聚醚類抗生素檢測方法主要有: 微 生 物 法［23－25］，免 疫 學 分 析 法［26－30］，光 譜法［31－33］，色譜法［21，34－38］，色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析法［39－46］等。

1 分析方法

1.1 微生物檢測法

微生物檢測法的原理是抗生素可以抑制微生物的生長，根據(jù)對某種抗生素敏感的微生物，在適當條件下所產(chǎn)生的抑菌圈大小與抗生素濃度呈正相關(guān)而設(shè)計的［22］。許多發(fā)達國家都有一套微生物檢測法快速檢測抗生素藥物在動物組織中殘留的方法，如美國棉簽法(STOP)、加拿大獸崽抗生素和磺胺制劑實驗法(CAST)。歐盟沒有提供統(tǒng)一的法定檢測方法，歐盟常用的方法為德國三碟實驗法，歐盟四碟實驗法等［23］。商軍等［24］采用枯草芽孢桿菌代替規(guī)定中所用的短小芽孢桿菌作為實驗用菌，并在培養(yǎng)基中(pH6.5～6.6)加入適量的磷酸氫二鉀，使測量更加準確，實驗重現(xiàn)性更好。李娜等［25］建立了雞肉組織中三種聚醚類抗生素殘留的微生物分析方法，測定了最低檢測限并篩選出枯草芽孢桿菌為最適工作菌，方法回收率均大于60%，莫能菌素、鹽霉素和馬杜霉素在各組織中的最低檢測范圍分別為1.25～21.5、0.4～20.6、1.75～22.0mg/kg，可滿足雞肉組織中莫能菌素、鹽霉素和馬杜霉素殘留分析的要求，所篩選出來的敏感菌檢測三種聚醚類抗生素的殘留填補了國內(nèi)空白，回收率高、重復性好、易于實踐操作及推廣。

微生物法實驗過程簡單，不需要大型的儀器設(shè)備，可同時篩選大量的樣品。但是特異性的菌株難刪選，檢測過程中會出現(xiàn)其它抗生素的干擾，使測定結(jié)果出現(xiàn)誤差。隨著人類對抗生素殘留限量要求越來越嚴格，這種方法已經(jīng)不能滿足檢測，但在小型工廠或儀器條件落后地區(qū)，仍可作為一種抗生素超標的初步篩查方法。

1.2 免疫學分析法

沈建忠等［26］首次使用IAC－ELISA方法測定雞組織中馬杜霉素的殘留。制備針對馬杜霉素的特異性抗體IgG和高容量IAC柱。各組織添加馬杜霉素30.0～120.0μg/kg水平下，測得樣本回收率為76.4%～109.0%，變異系數(shù)為 3.8%～16.4%。Watanabe H等［27］通過制備人工抗原免疫小鼠獲得單克隆抗體，建立了雞血漿和肌肉中鹽霉素殘留的ELISA檢測法和免疫層析分析法，鹽霉素ELISA法的檢測范圍為0.05～25.6μg/kg，免疫層析法在血漿和肌肉基質(zhì)中的檢出限分別為50、300μg/kg，另外他們還建立的拉沙洛菌素、賽杜霉素的ELISA檢測法在雞的肝臟和肌肉中的定量限分別為10、5μg/kg，拉沙洛菌素、賽杜霉素的免疫層析法檢測的檢出限分別為125、100μg/kg。Peippo P等［28］建立了甲基鹽霉素和鹽霉素在雞肉和雞蛋中殘留的時間分辨熒光免疫測定法(TR－FIR)，該方法中只有甲基鹽霉素經(jīng)過確證實驗，其在雞肉和雞蛋中的定量限分別為1.80、0.57μg/kg，雞肉中甲基鹽霉素6個平行樣品，在添加量2μg/kg下平均回收率為91.0%，變異系數(shù)為4.6%，雞蛋中甲基鹽霉素6個平行樣品，1μg/kg添加量的平均回收率為81.1%，變異系數(shù)為6.4%。Virve Hagren等［29］開發(fā)了莫能菌素的時間分辨熒光免疫法，用來測定雞蛋中的莫能菌素殘留。方法的定量限低于2μg/kg，平均回收率在88.0%～102.1%之間，變異系數(shù)低于10%，在n=18的平行實驗中變異系數(shù)在10.3%～13.9%之間。Hyo Jeong Lee等［30］人研究了免疫老鼠產(chǎn)生的單克隆抗體，用ELISA檢測3種聚醚類抗生素的蛋白軛合物，為單克隆抗體同時檢測莫能菌素、鹽霉素、萊特洛霉提供了可靠的依據(jù)。

免疫法試樣前處理簡單、分析用時短、適合大量樣品的分析、儀器化程度和分析成本低，是藥物殘留篩選性分析較理想的方法之一。目前，聚醚類物質(zhì)的檢測已經(jīng)出現(xiàn)一些試劑盒產(chǎn)品，該方法在基層的大量樣品篩選和現(xiàn)場監(jiān)測中有著廣闊的應用前景和重大的應用價值。

1.3 光譜法

光譜法檢測聚醚類抗生素藥物主要是分光光度計法，但是由于聚醚類物質(zhì)本身沒有紫外吸收基團，因此需要加入顯色劑。曾兆國等［31］研究了分光光度法測定發(fā)酵液中莫能菌素含量的方法，該方法使用UV－1700紫外分光光度計，檢測波長560nm，以無水甲醇為溶劑，3%香草醛溶液為顯色劑，顯色溫度45℃，顯色時間 20m in，莫能菌素濃度在 20～140μg/m L范圍內(nèi)與吸光度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)0.9996(n=7)，回收率為 100.2%，RSD為 0.747%(n=9)，此方法適合于測定莫能菌素在發(fā)酵液及中間體預混劑的含量。曾兆國等［32］還開發(fā)了分光光度法測定發(fā)酵液中鹽霉素含量的方法，檢測波長為520nm，以無水甲醇為溶劑，3%香草醛溶液為顯色劑，顯色溫度50℃，顯色時間15min，鹽霉素濃度在20～120μg/kg范圍內(nèi)與吸光度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)0.9999(n=6)，回收率為100.1%，RSD為0.519%(n=9)。張凱，任玉琴［33］研究了528nm波長下測定鹽霉素含量的方法，以95%乙醇為溶劑，4%香草醛溶液為顯色劑，顯色溫度70～74℃，顯色時間40m in，鹽霉素濃度在40～280μg/m L范圍內(nèi)與吸光度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)0.9996(n=6)，回收率在100.1%～100.8%(n=5)，RSD 在0.8%～1.2%。

分光光度法檢測限高，干擾大，但是前處理方法簡單，主要適用于配合飼料、濃縮飼料中聚醚類抗生素的分析檢測，并且無需昂貴的大型儀器，適合于飼料廠和基層檢測機構(gòu)對加藥產(chǎn)品的質(zhì)量檢測和控制。

1.4 色譜法

色譜法主要是采用高效液相色譜法(HPLC)和薄層色譜法(TLC)檢測動物性食品中的聚醚類抗生素，由于薄層色譜法操作誤差大，假陽性突出，檢出限高，已經(jīng)很少用于聚醚類抗生素的檢測分析，所以現(xiàn)在分析工作中的色譜法主要是高效液相色譜法(HPLC)。陳笑梅等［34］用高效液相色譜柱后衍生法檢測雞肉中鹽霉素的含量，樣品用甲醇－水溶液勻漿、提取后過濾，再用二氯甲烷進行液液萃取，然后通過Sep－Pak柱進一步凈化。凈化后的樣液與香蘭素衍生試劑在酸性和加熱條件下進行柱后衍生，反應產(chǎn)物在520nm波長處測定。莫能菌素在20～200ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9991，n=6)。方法回收率為88.1%～101.3%，變異系數(shù)為0.1%～0.73%。李燕鵬等［35］用高效液相色譜柱前衍生化法檢測牛奶中莫能菌素的殘留。馬立農(nóng)等［36］以甲醇∶1%醋酸水溶液(90∶10，v/v)為流動相，2，4－二硝基苯肼(DNP)為衍生劑，應用高效液相色譜柱前衍生化法，采用紫外檢測方法對飼料中的鹽霉素進行了測定，其線性關(guān)系理想，重現(xiàn)性好。采用此方法測得的總回收率為89.06%，總變異系數(shù)為1.73%，此方法的檢測限為1mg/kg。Tracey L等［37］采用柱后衍生液相色譜法檢測雞肉、雞皮脂肪組織、雞腎和雞肝中甲基鹽霉素的殘留，樣品經(jīng)提取液提取后經(jīng)固相萃取柱萃取，用香草醛柱后衍生，在520nm 下檢測，在25、50、100μg/kg三個添加濃度下，回收率為80.7%～83.1%，線性關(guān)系良好，相對標準偏差在3.5%～6.5%之間，方法儀器檢出限為7.04μg/kg，方法儀器定量限為25μg/kg。吳銀良等［38］建立了雞組織中甲基鹽霉素的高效液相色譜柱后衍生化分析方法，用香草醛作為衍生劑，520nm 檢測，方法檢出限 6μg/kg，定量限 20μg/kg，添加濃度在20～1800μg/kg范圍內(nèi)，平均添加回收率為76.4%～93.1%，批內(nèi)相對標準偏差在2.6%～8.9%之間，批間相對標準偏差在4.7%～9.7%之間。

HPLC法是檢測分析中最常用的方法，有很多國際通用檢測方法使用HPLC法，我國農(nóng)業(yè)部2003年發(fā)布的聚醚類物質(zhì)檢測方法使用的就是該方法。利用聚醚類物質(zhì)經(jīng)過衍生后有紫外吸收的特性，用HPLC柱前或柱后衍生來測定聚醚類物質(zhì)，其檢測下限低，方法準確，重現(xiàn)性好。目前高效液相色譜法可以滿足大多數(shù)基質(zhì)中聚醚類物質(zhì)的檢測，而且因為儀器相對液質(zhì)聯(lián)用等儀器價格低廉，各地區(qū)普及廣，在日常監(jiān)測中有重要的使用意義。

1.5 分析聯(lián)用技術(shù)

常用的聯(lián)用方法有液相色譜－質(zhì)譜法(LC－MS)、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC－MS－MS)、氣相色譜質(zhì)譜法(GC－MS)、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(GC－MSMS)。在獸藥分析中最常用的是高效液相色譜－質(zhì)譜法(HPLC－MS)和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC－MS－MS)，此類分析方法是通過一定的接口技術(shù)將液相色譜和質(zhì)譜連接起來，利用液相色譜的分離作用和質(zhì)譜的定性和定量作用，分析檢測物質(zhì)的成分和含量?，F(xiàn)有的聚醚類藥物的分析聯(lián)用檢測方法中主要是液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC－MSMS)。

我國于2006年發(fā)布實施了動物源產(chǎn)品中聚醚類殘留量的測定的國家標準GB/T 20364－2006，采用HPLC－MS－MS法檢測禽、兔等動物源產(chǎn)品中莫能菌素、鹽霉素和甲基鹽霉素殘留量［39］。樣品經(jīng)異辛烷提取，經(jīng)硅膠萃取柱凈化，蒸干后，過膜上機，采用甲醇和0.1%甲酸水溶液梯度洗脫，方法線性范圍為5～100μg/kg，最低檢出限為 0.1μg/kg，定量限為5.0μg/kg。2009年我國發(fā)布了牛奶和奶粉中的6種聚醚類殘留量檢測的國家標準 GB/T 22983－2008［40］。Estelle Cheneau 等［41］建立了雞的血漿和可食組織中莫能菌素的檢測方法，并將該方法應用于藥物動力學的研究。實驗采用甲基鹽霉素為內(nèi)標物質(zhì)，流動相為含0.1%甲酸的水和乙腈，梯度洗脫，質(zhì)譜電離方式是電噴霧電離，針對血漿、雞肉、雞肝、雞脂肪有兩種前處理方法。在五個添加濃度上，回收率在58.7%～107.0%之間，相對標準偏差在2.8%～13.3%之間，方法的定量限為2.5μg/kg。該方法定量準確，可適合微量莫能菌素的分析。畢言鋒等［42］建立了用UPLC－MS/MS同時測定雞肉中莫能菌素和鹽霉素殘留檢測方法。在國內(nèi)外已有研究的基礎(chǔ)上，對樣品前處理和儀器條件進行了改進，采用乙腈提取，石墨化碳黑SPE小柱對提取液進行凈化，然后用Waters ACQU ITY UPLCTMTQD超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。結(jié)果表明，莫能菌素和鹽霉素的檢測限為0.2μg/kg，最低定量限為0.5μg/kg。選取0.5、1.0、2.0μg/kg三個濃度進行空白添加回收率實驗，回收率為71.9%～95.1%，批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均小于15%，適合大量雞肉樣品中莫能菌素和鹽霉素的殘留檢測。Ursula Vincent等［43］建立了家禽和家畜混合料中6種聚醚類物質(zhì)、莫能菌素A、鹽霉素、甲基鹽霉素(甲基鹽霉素A和甲基鹽霉素I)、拉沙洛菌素和馬杜拉霉素的液相串聯(lián)質(zhì)譜的檢測方法。該方法在1、5、10mg/kg三個濃度進行空白添加回收，方法的相對標準偏差在4%～10%之間，平均回收率在86%～120%之間。6種聚醚類物質(zhì)在家禽飼料基質(zhì)中檢出限在0.003～0.014mg/kg之間，定量限在0.010～0.046mg/kg之間，在家畜飼料基質(zhì)中檢出限在0.001～0.008mg/kg之間，定量限在 0.004～0.026mg/kg 之 間。Ma?gorzata Olejnik 等［44］使 用HPLC－MS/MS分析了雞肝中12種球蟲抑制藥，包括六種聚醚類抗生素莫能菌素、鹽霉素、拉沙菌素、馬杜拉霉素、賽杜霉素和其他六種化學合成的抗球蟲藥。流動相選用乙腈、甲醇和pH4.0甲酸銨梯度洗脫，25m in可分析12種球蟲抑制藥。n=20時，該方法的回收率在81.2%～120.1%之間，除拉沙菌素變異系數(shù)為35.2%～48.2%外，其余11種物質(zhì)變異系數(shù)都在5.1%～28.2%之間，滿足方法的統(tǒng)計學要求。該方法的儀器檢出限在0.4～2.77μg/kg之間，方法的儀器定量限為 1.0～7.30μg/kg。薄海波等［45］建立了超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛奶和奶粉中6種聚醚類抗生素殘留量，樣品經(jīng)乙腈提取后，過HLB柱凈化，6種抗生素在0.5～100.0μg/kg范圍內(nèi)均呈線性，相關(guān)系數(shù)r大于0.99，平均回收率在74.0%～98.5%之間，精密度(RSD)4.8%～17.2%，牛奶中6種聚醚抗生素檢出限均為0.2μg/kg，奶粉中6種聚醚抗生素檢出限均為1.6μg/kg。梁春來等［46］建立了雞組織中聚醚類藥物多殘留檢測的高效液相色譜－電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜方法。采用甲醇提取雞組織中的拉沙洛菌素、鹽霉素、莫能菌素、甲基鹽霉素和馬杜霉素，經(jīng)硅膠柱凈化，當5種聚醚類藥物的添加水平為雞肉0.1～1500μg/kg、雞肝 0.2～4500μg/kg 時，平均回收率為71.6%～99.1%，日內(nèi)測定的相對標準偏差(RSD)(n=5)為 3.2%～10.7%，日間 RSD(n=3)為 4.6%～14.7%。2種雞組織中5種聚醚類藥物的定量限為0.1～1.0μg/kg。該方法的靈敏度、準確度和精密度均符合獸藥殘留分析技術(shù)的要求，適用于雞肉和雞肝中5種聚醚類藥物的多殘留檢測。

液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法是現(xiàn)行獸藥分析中最常用、最精確的儀器分析方法，也是很多生物檢測方法的確證方法。其利用物質(zhì)的特征離子和保留時間定性和定量，準確分析各種基質(zhì)中的聚醚類抗生素。該法樣品前處理相對單獨的色譜較簡單，抗干擾能力強，檢出限低，靈敏度高，可滿足各國各種基質(zhì)下對聚醚類抗生素的檢測需求。

3 討論

近年來我國聚醚類抗生素殘留檢測法的研究發(fā)展迅速，但相對國外，在免疫分析以及色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)上仍有差距。以后檢測技術(shù)發(fā)展的方向是快速檢測和多殘留檢測，同時要有低的假陽性和高的靈敏度。現(xiàn)有的聚醚類物質(zhì)檢測方法中，只有分光光度計法快速便捷，但是由于其靈敏度低，而且易受雜質(zhì)干擾，所以無法大規(guī)模推廣。根據(jù)以上情況，提出如下建議:a.針對日常較多戶外檢測任務或沒有大型儀器的檢測點，應該開發(fā)酶聯(lián)免疫試劑盒，并且要開發(fā)多殘留的酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒，在保證靈敏度的同時一次檢測多種聚醚類物質(zhì)。b.在大規(guī)模的實驗室和國家行政檢測單位應該開發(fā)多種基質(zhì)下使用大型儀器的檢測方法。在檢測方法的研發(fā)中，應從改進前處理方法上著手，開發(fā)藥物種類較多、適用基質(zhì)范圍更廣、多殘留和低濃度檢測的HPLC－MS/MS方法。c.應該著重探索聚醚類抗生素的快速分析技術(shù)，如前處理應用的分子印跡 SPE固相萃取柱［47－48］，以及分子印跡基礎(chǔ)上的 SPR 傳感器檢測技術(shù)［49］，膠體金免疫檢測技術(shù)［50］、金納米顆粒表面等離子體傳感器技術(shù)［51］。隨著人類食品安全意識的提高，對抗生素類物質(zhì)的檢測下限的要求越來越低，限制藥物的種類越來越多，對檢測技術(shù)的要求也越來越高，和國外相比，我國的檢測技術(shù)起步晚，雖然最近幾年發(fā)展較快，但仍處于比較落后的位置，因此需要更多的專業(yè)人才投入到多殘留藥物檢測的研究中。

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Detection and research progress of polyether antibiotics

LIU Jia－jia，SHE Yong－xin，LIU Hong－bin，JIN mao－jun，SHAO Hua，JIN Fen，WANG Jing*
(Key Lab of Agro－product Quality and Safety，Institute of Quality Standards＆ Testing Technology for Agro－products，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China)

Polyether antibiotics are widely used in livestock breeding as coccidiostats，the detection technology research of polyether antibiotics is of great importance for controlling excessive residues of veterinary d rug and ensuring the safety of livestock products.Analytical methods of polyether antibiotics including the research situation of microbiological method，immunoassay，spec trophotometer method，chromatography and liquid chromatography tandem mass spec trometry were introduced in details.Problems existed in this research field and further developing tends were also discussed.This review provided a reference for the analysis of polyether antibiotics in various matrices.

polyether antibiotics;residue;determination;research progress

TS201.2

A

1002－0306(2011)08－0440－06

2010－06－22 *通訊聯(lián)系人

劉佳佳(1986－)，碩士，研究方向:食品安全檢測技術(shù)。

“十一五”國家科技支撐計劃資助項目(2006BAD12B03－06)。