田建華

(山西省林業(yè)科學(xué)研究院，山西 太原 030012)

原花青素(procyanidins)為低聚黃烷化合物的總稱，由不同數(shù)目的黃烷-3-醇或黃烷-3，4-二醇聚合而成，該類物質(zhì)通常能在熱酸作用下產(chǎn)生花青素(anthocyanidin)。研究表明，原花青素是天然的抗氧化劑，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域，其抗氧化和清除自由基的能力是VitE的50倍，VitC的20倍。我國(guó)沙棘(Hippophae rhamnoides L.)資源豐富，隨著食品工業(yè)的發(fā)展，出現(xiàn)了大量的加工廢棄物，沙棘果廢渣是沙棘果經(jīng)壓汁后的殘?jiān)?包括果皮、果肉和種子)。劉朵花等報(bào)道沙棘籽可能是更好的低聚原花青素的來源。筆者通過正交試驗(yàn)探索了超臨界CO2脫脂后沙棘果廢渣中原花青素的最佳提取工藝，同時(shí)采用大孔吸附樹脂對(duì)原花青素提取物進(jìn)行分離純化，以期獲得有價(jià)值的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

沙棘果廢渣，由山西省岢嵐縣山地陽(yáng)光食品有限公司提供;乙醇，為食用級(jí);其他試劑，為分析純;兒茶素標(biāo)準(zhǔn)樣品，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，純度 98%以上;AB-8型，D-101型，DM130型，DM-301型大孔吸附樹脂，由天津市海光化工有限公司生產(chǎn);721分光光度計(jì)，由上海第三分析儀器廠制造;1 L超臨界CO2萃取裝置，由廣州輕工業(yè)研究所制造。

1.2 方法

1.2.1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取干燥至質(zhì)量恒定的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)樣品10 mg，加甲醇溶解并定容至100 mL的容量瓶中，搖勻得質(zhì)量濃度為0.1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取上述兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.4 mL，0.8 mL，1.2 mL，1.6 mL，2.0 mL，3.0 mL于6只比色管中，各加入6 mL質(zhì)量濃度為40 g/L的香草醛-甲醇溶液和3 mL濃鹽酸，搖勻。置于(20±1)℃溫度下避光反應(yīng)15 h，于500 nm處測(cè)吸光度，甲醇為空白參比。以兒茶素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得兒茶素質(zhì)量濃度與吸光度之間的回歸方程:A=2.1c+0.032，R2=0.999 9.

1.2.2 樣品溶液的制備與測(cè)定

取自然干燥、粉碎至0.85 mm～1.70 mm的沙棘果廢渣200 g，裝入超臨界CO2萃取釜，參考脂溶性物質(zhì)的超臨界CO2萃取文獻(xiàn)資料，采用一級(jí)分離，在萃取壓力為24 MPa，溫度35℃，分離壓力8 MPa，溫度48℃的條件下，萃取3 h，收集脫脂后的沙棘果廢渣。準(zhǔn)確稱取脫脂后的沙棘果廢渣9份，每份10 g，按正交試驗(yàn)表中所選取的因素水平進(jìn)行常規(guī)乙醇提取。分別吸取一定量提取液于9只比色管中，依次加入6 mL質(zhì)量濃度為40 g/L的香草醛-甲醇溶液和 3 mL濃鹽酸，混勻。置于(20±1)℃條件下避光反應(yīng)15 h，測(cè)定吸光度，計(jì)算原花青素得率。

1.2.3 樹脂純化

取脫脂后的沙棘果廢渣200 g，按照最佳工藝進(jìn)行提取，得到的粗提物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，冷藏備用。通過對(duì)吸附量和洗脫率的考察，篩選出對(duì)原花青素效果較好的樹脂進(jìn)行濕法裝柱(色譜柱2.5 cm×30 cm，柱體積50 mL)，將備用樣生藥質(zhì)量濃度4.0 g/L，以1.0 BV/h流速加到柱上端進(jìn)行吸附，吸附后的樹脂先用水洗至洗脫液無色，再分別用30%，50%，70%，90%乙醇溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，控制洗脫流速為2.0 BV/h，分別收集不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫液，測(cè)定其中原花青素的純度和得率。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳提取工藝的選擇

選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間和料液比4個(gè)因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察各因素對(duì)原花青素得率的影響，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1.

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)數(shù)據(jù)

利用Spss統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)A，B，C，D這4個(gè)因素進(jìn)行分析，結(jié)果見表2.

表2 方差分析

重復(fù)驗(yàn)證結(jié)果見表3.

表3 重復(fù)驗(yàn)證

從表2可以看出，各因素作用依次為B＞C＞A＞D，其中因素B有極顯著性差異，因素C和A有顯著性差異，因素D無顯著性差異。直觀分析得最佳工藝條件為A3B1C1D3，即用70%的乙醇為溶劑，料液比為1∶7，控制溫度為40℃，提取1 h.在此條件下，進(jìn)行2次重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)得原花青素得率平均為3.67%，較正交試驗(yàn)中各試驗(yàn)原花青素得率高。

2.2 原花青素提取物的分離純化

2.2.1 大孔吸附樹脂的篩選

4種樹脂靜態(tài)飽和吸附與洗脫試驗(yàn)結(jié)果見第13頁(yè)表4.

表4 4種樹脂靜態(tài)飽和吸附與洗脫試驗(yàn)

從表4可以看出，AB-8，D-101，DM130樹脂對(duì)原花青素有較強(qiáng)的吸附能力，DM-301的吸附能力相對(duì)較小。AB-8和DM130為弱極性樹脂，這可能是由于原花青素含有酚羥基，具有一定的極性，有利于弱極性樹脂的吸附，但是吸附后不易洗脫。非極性樹脂D-101對(duì)原花青素有較高的吸附能力，可能是因?yàn)樵ㄇ嗨胤肿又械谋江h(huán)能夠與吸附樹脂形成疏水作用，而且容易洗脫，洗脫率達(dá)95%.因此，選擇D-101樹脂對(duì)原花青素進(jìn)行分離純化效果最佳。

2.2.2 洗脫劑類型的選擇

洗脫劑類型的選擇結(jié)果見表5.

表5 D-101大孔吸附樹脂純化試驗(yàn) %

從表5可以看出，水洗脫液產(chǎn)品得率很低，經(jīng)檢測(cè)原花青素純度僅為1.63%，大部分為水溶性色素及糖類化合物。70%的乙醇洗脫液原花青素純度雖較高，但得率較低;50%的乙醇洗脫效果最好，總提取物得率為1.34%，原花青素純度可達(dá)73.3%，均為最高值。

3 結(jié)論

1)沙棘果廢渣中原花青素的提取最佳工藝參數(shù)為:70%的乙醇溶液，料液比1∶7，提取溫度40℃，提取時(shí)間1 h.重復(fù)試驗(yàn)測(cè)得原花青素得率平均為3.67%，比正交試驗(yàn)中其他試驗(yàn)的原花青素得率高，所得試驗(yàn)結(jié)果合理可行。

2)實(shí)驗(yàn)表明，D-101型大孔吸附樹脂對(duì)沙棘原花青素有較大的靜態(tài)吸附量，為69.2 mg/g，洗脫率為95%，高于其他3種大孔吸附樹脂，是分離純化沙棘原花青素的最佳樹脂。

3)在選定樹脂后，分別對(duì)影響D-101型樹脂的吸附和洗脫因素進(jìn)行了考察(該研究?jī)?nèi)容將另文發(fā)表)。研究表明，50%的乙醇洗脫劑效果最好，洗脫流速為2.0 BV/h，洗脫劑用量為4.0 BV，可得到總提取物得率為1.34%，原花青素純度為73.3%的沙棘原花青素產(chǎn)品。

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