王蘋蘋，孔繁平，陳學群，杜繼曾 綜述

(浙江大學醫(yī)學院基礎醫(yī)學系，浙江 杭州 310058)

氧是機體進行新陳代謝的必需物質，缺氧對機體和細胞是一種強烈的應激。細胞通過氧感受器和信號轉導通路特異地調節(jié)某些基因或蛋白的表達來適應低氧［1］。HIF-1α是哺乳動物維持氧平衡最主要的調節(jié)因子。近10年來，低氧研究主要集中在HIF-1α介導的基因轉錄調控方面。低氧可以增加HIF-1的穩(wěn)定性，促進HIF-1與低氧反應元件(hypoxia response element，HRE)的結合，從而誘導低氧靶基因的激活。此外，HIF通路和其它信號通路間也存在交叉調節(jié)，形成了細胞低氧應答的特異性和多樣性。

1 低氧誘導因子HIF-1

1.1 HIF-1的基本結構 HIF-1是由分子量為120 kD的 HIF-1α和分子量為91－94 kD的HIF-1β或稱芳香烴受體核轉位蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT)2種亞基組成的異源二聚體［2］，2亞基均屬于basic helix-loop-helix(bHLH)/PER-ARNT-SIM(PAS)家族蛋白［3］，N 末端均含有 bHLH/PAS同源區(qū)。bHLH區(qū)和N末端PAS中間區(qū)對于二聚化以及與靶基因的結合必不可少。HIF-1α亞基的中部有一個氧依賴降解結構域(oxygen dependent degradation domain，ODDD);C 端是反式激活區(qū)，包括2個反式激活域(transactivation domain，TAD)即 TAD-N(amino acids 531-575)和TAD-C(amino acids 786-826);2個TAD序列間的區(qū)域為抑制結構域(inhibitory domain，ID;amino acids 576-785)，抑制TAD的轉錄激活［4］。

HIF-α 亞基包括 HIF-1α、HIF-2α 和 HIF-3α，這3種HIF-α的亞型都由氧來調節(jié)其蛋白的穩(wěn)定性，在低氧條件下可以與HIF-1β結合調節(jié)靶基因的轉錄。HIF-1α和HIF-2α在結構上有48%的氨基酸序列是相同的，能識別同樣的DNA結合區(qū)，但各自又有獨特的生物學效應。有研究表明，HIF-2α參與長期慢性的低氧反應，而 HIF-1α 則與急性低氧反應有關［5］。HIF-3α不誘導激活 HIF的靶基因，大鼠HIF-3α有1個僅包含bHLH和PAS區(qū)的IPAS蛋白(inhibitory PAS domain protein)，IPAS對HIF調節(jié)的基因表達可能起負反饋抑制作用，IPAS可以和HIF-1α結合形成沒有功能的二聚體，這個二聚體在細胞核內不能與靶基因的低氧反應元件結合，形成了一種細胞特異或環(huán)境特異的應對低氧的策略［6］。

1.2 HIF-1α蛋白的功能調節(jié) HIF-1α位于細胞質中，在常氧下極易降解，半衰期不足5 min;但在低氧下HIF-1α穩(wěn)定性和轉錄活性都顯著增加，其主要有2條氧依賴的途徑調節(jié)HIF-1α蛋白穩(wěn)定性和轉錄活性:①FIH-1(factor-inhibiting HIF-1)是一種氧依賴性酶，可將HIF-1α C末端反式激活結構域內803位的天冬氨酸殘基羥基化，阻止HIF-1α與轉錄輔助激活因子CBP(CREB-binding protein)/p300結合，從而抑制 HIF-1α 的轉錄激活功能［7］。②脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase，PHDs)也是氧依賴性酶，可以使HIF-1α的564位(HIF-2α的531位)和402位的脯氨酸殘基被羥基化，然后腫瘤抑制蛋白(von hippel-lindau protein，pVHL)與 HIF-1α亞基的 ODDD結合，募集多種泛素蛋白，共同組成泛素連接蛋白酶復合體，使HIF-1α亞基泛素化，并經(jīng)泛素連接蛋白酶復合體途徑降解［8］。不同組織中PHDs的表達不同，與不同HIF蛋白的親和力也不盡相同，這可能導致了低氧應答的多樣性。在低氧下，PHDs和FIH-1的活性被抑制，HIF-1α不被降解，導致胞內蛋白水平迅速增加。在HIF-1α蛋白C末端有核定位信號(NLS)，輔助HIF-1α蛋白快速和核孔蛋白結合入核。HIF-1β在缺氧及正常細胞的胞漿和核中均存在，其與HIF-1α的N末端激活域結合，形成二聚體后與CBP/p300結合開始轉錄。

HIF-1α在轉錄后可被 SUMO(small ubiquitin-like modifier)修飾，這是一個被SUMO特異性連接酶催化和被SUMO特異性蛋白酶(SENPs)逆轉的動態(tài)過程。這些生理過程現(xiàn)在并未研究清楚，有些報道也有矛盾之處。HIF-1α活性的增加和抑制都有報道，而且低氧可以增加 HIF-1α 的 SUMO 修飾［9］，而 SUMO 修飾能通過脯氨酸殘基的羥基化來增強HIF-1α和VHL的結合，導致HIF-1α的泛素化降解。相反，SENPs參與的HIF-1α去SUMO修飾可以避免其在低氧下被降解［9］。HIF-1β同樣能被SUMO修飾，調節(jié)與其它蛋白的關系［10］。但是，這種SUMO修飾對HIF-1β和HIF-α蛋白的相互作用機制目前尚不清楚。

最近，研究者發(fā)現(xiàn)了很多可以調節(jié)HIF-1α活性的蛋白質和小分子物質。HIF-1α可以被NO介導的亞硝基化修飾，從而增強常氧條件下的蛋白穩(wěn)定性和活性［11］。熱休克蛋白90(heat shock protein 90，Hsp90)可以氧依賴的結合在HIF-1α的PAS區(qū)，阻止HIF-1α的泛素化降解。RACK1(receptor for activated protein C kinase 1)與Hsp90競爭結合在HIF-1α的PAS結構域，從而增加 HIF-1α的降解。17-AAG(17-allylaminogeldanamycin)是 Hsp90的抑制物，它可以阻斷Hsp90與HIF-1α的結合，促進RACK1的結合，激活HIF-1α泛素化降解［12］。

2 低氧反應元件HRE

HRE是一個復雜的調節(jié)元件，由保守的HIF-1結合位點(HIF-1 binding site，HBS)A/GCGTG和高度可變的旁側序列組成［13］。HIF-1α亞基穩(wěn)定后向核內轉移，與β亞基二聚化形成HIF-1結合在低氧反應元件HRE上。與HIF通路調控相比，目前對HRE序列的特征了解還很少，只知道在低氧轉錄激活作用中HRE是最小的一個順式調節(jié)元件［14］。100多個研究表明，在有功能的HBS序列中特定核苷酸有特定的位置，也就是說HBS的核心序列呈現(xiàn)非隨機性，不一定就是 N(－3)N(－2)A/G(－1)C(1)G(2)T(3)G(4)。A在－1位置的概率是4.5倍，而T出現(xiàn)在 －3位置的概率是4.2倍［13］。有一些研究報道了HRE序列與它調控功能之間的關系，比如突變分析－2位置發(fā)現(xiàn)低氧誘導作用按 T＞G＞C的順序下降。回文序列CACGTG之所以低氧誘導作用低可能是該序列競爭結合了一些抑制因子，如HIF-1β的同源二聚體。內皮素1(endothelin-1，ET-1)的 HRE AACGTG的低反應性也認為HBS序列－2位置的核苷酸有重要關系［16］。

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因轉錄起始點上游大約1 kb的5'側翼區(qū)域有286 bp的HRE。HRE區(qū)域內存在HBS 5'ATCGTGGG3'和HIF-1結合的輔助序列(HIF-1 ancillary sequence，HAS)5'CACAG3'［16］。兩者是低氧 VEGF 轉錄激活的順式作用元件，調控VEGF在低氧條件下的轉錄。EPO基因的3'端上存在一個低氧反應元件，HIF-1識別5'-TACGTGCT-3'，特異性地結合在這個反應元件上，調節(jié)EPO基因在低氧下的轉錄水平［3］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，人類肝癌細胞(HepG2)轉染含有類胰島素樣生長因子結合蛋白1(insulin-like growth factor binding protein，IGFBP-1)調控區(qū)，分別暴露于20% 和1% 氧濃度24 h，結果發(fā)現(xiàn)HIF-1結合在斑馬魚胚胎的IGFBP-1基因調控區(qū)的HBS上。－1086/－1090處的 HBS 3'-ACGTG-5'和 －1099/－1103處HAS 3'-CAGGT-5'對于低氧誘導IGFBP-1的表達都是重要的［17］。HAS位于HRE上游8 bp處，在HIF-1誘導斑馬魚IGFBP-1的激活中是必不可少的。HAS并不是直接與HIF-1作用的，也不影響它鄰近HRE與HIF-1的結合。常氧條件存在一種核蛋白與HAS相結合，而這種物質以及它的作用目前尚不清楚。但是，在鐵轉運蛋白中HRE是由2個鄰近的HBSs形成，在各種糖分解的酶以及葡萄糖轉運體中HRE是由鄰近2或3個HBSs組成的［18］。

一個HBS是必要的，但是不足以激活低氧反應，高度可變的旁側序列結合其它不一定與低氧有關的轉錄因子，使HRE調節(jié)達到頂峰，這對于增強低氧反應或形成HRE的細胞特異性有重要作用［8］。在乳酸脫氫酶 A(lactate dehydrogenase A，LDHA)基因的HRE中有轉錄激活因子1和cAMP反應元件結合蛋白-1(ATF-1/CREB-1)的結合位點［19］。GATA 結合轉錄因子2(GATA-binding transcription factor-2，GATA-2)和AP-1元件對于ET-1的高表達是必要的［20］。VEGF基因HRE中發(fā)現(xiàn)AP-1的結合位點，在EPO基因HRE中有肝細胞核因子4(hepatic nuclear factor 4，HNF-4)的結合位點［21］。HRE的多樣性可能增強了低氧反應性和不同組織的反應特異性，豐富了靶基因的多樣性［18］。

3 HIF-1在不同疾病中的作用

HIF-1通過激活靶基因的轉錄，在低氧相關的生理狀態(tài)和病理過程中發(fā)揮作用，目前已知有70多種基因受HIF-1調節(jié)［22］。

3.1 HIF-1在缺血誘導的血管生成中的作用 HIF-1的活性對于組織缺血后的恢復是十分必要的。HIF-1可以上調與血管系統(tǒng)相關蛋白的基因表達，如促進血管生成的VEGF及其受體;使血管收縮的物質，如誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、ET-1 和血紅素氧化酶1(heme oxygenase-1，HO-1)等來增加血流，降低缺血損傷。在HIF-1α基因敲除的股動脈結扎模型中，發(fā)現(xiàn)VEGF等血管生長因子沒有被激活，缺血后再灌注能力降低［23］。在其它的損傷模型中也發(fā)現(xiàn)，HIF-1α的促血管生成作用，包括心肌肥大、心肌梗塞、傷口愈合和視網(wǎng)膜血管再生等模型［24-26］，而 HIF-2α在這些模型中的促血管生成作用并不明顯［27］。這些結果表明，HIFα尤其是HIF-1α在缺血組織中介導促血管生成的作用。此外，在胚胎發(fā)育中，HIF-1對胚胎血管系統(tǒng)的建立和發(fā)育也至關重要［28］。

3.2 HIF-1在缺血后細胞代謝中的作用 在動脈粥樣硬化疾病中，心臟、腦和肌肉這些組織都可能處于缺血狀態(tài)，HIF-1的激活對它們適應缺血起關鍵作用。HIF-1參與重建細胞代謝途徑來實現(xiàn)對心臟和腦組織的保護。因為氧作為線粒體呼吸電子傳遞鏈的受體，低氧適應的關鍵是將代謝途徑轉到非氧化的碳代謝和ATP產(chǎn)生途徑，如糖酵解。HIF能啟動葡萄糖轉運體和LDHA來介導這個通路的轉換。HIF-1的另一個靶基因丙酮酸脫氫酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase-1，PDK1)編碼的 PDK蛋白可以抑制乙酰輔酶A的合成，阻斷三羧酸循環(huán)，降低氧消耗［29］。HIF-1缺失的細胞在低氧后ATP產(chǎn)量降低，產(chǎn)生更多的氧自由基，促使其凋亡［29］。最近的研究顯示，HIF-1的激活還能影響磷酸戊糖途徑［30］，這條途徑能將糖酵解的中間產(chǎn)物轉化為合成核苷酸的重要原料5-磷酸核糖。這些研究結果表明，HIF-1依賴的代謝通路的轉換，能促進細胞在低氧下存活，而且HIF-1將葡萄糖代謝轉換成RNA和DNA合成所需的一個步驟，這對于低氧腫瘤細胞的存活和生長可能有重要意義。

3.3 HIF-1在癌癥發(fā)生中的作用 腫瘤細胞的快速增殖導致血液供應不足使腫瘤細胞經(jīng)常處于低氧環(huán)境，所以腫瘤組織中HIF通常高表達［32］。此外還有一些非低氧依賴激活HIF的途徑，比如在腎癌細胞中VHL的突變，在結腸癌中Wnt通路的突變導致 HIF穩(wěn)定性的提高［32］。研究顯示，HIF調節(jié)的不同靶基因在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程都有關鍵作用，包括增殖(Myc家族、IGF家族)、血管生長(VEGF、EPO)、凋亡/自噬(BNIP3、NIX)、代謝(PDK1、LDHA)、DNA損傷(GADD45A)、胞內基質重構(MMP1、LOX)、細胞遷移和逃逸(CXCR4)［32］。然而，不同的HIFα亞基在腫瘤發(fā)生中有不同的功能，在VHL敲除的細胞研究中顯示，可能是HIF-2α而不是HIF-1α對于腫瘤發(fā)生是必需的［32］，一種可能的解釋是 HIF-1α 抑制了 Myc的功能［33］。另外，低氧HIF-1α能與p53結合，誘導p53的穩(wěn)定和細胞凋亡［34］。相反，HIF-2α間接抑制p53的活性而提高腫瘤細胞對輻射和化學物質的抵抗［35］。目前以HIF為靶點的研究給癌癥治療提供了新的策略。

3.4 HIF-1在細胞自噬中的作用 低氧(氧濃度＜3%)和缺氧(氧濃度＜0.1%)都能誘導細胞的自噬甚至是凋亡，然而這兩種情形有不同的分子機制。低氧引起的自噬是HIF依賴的途徑，而缺氧引起的自噬則是非HIF依賴的途徑［36-37］。在低氧下(氧濃度1% ～3%)，HIF 激活BNIP3和NIX(BNIP3L)的轉錄，進而抑制Beclin1和Bcl-2的功能［38］，導致細胞凋亡。另外，位于線粒體外膜的NIX表達WXXL基序，其被LC3識別并結合，導致線粒體產(chǎn)生自噬。BNIP3的轉錄還可以被轉錄因子FOXO3激活，而FOXO3和HIF共同被Sirt1所調節(jié)［39］。

3.5 HIF-1在炎癥反應中的作用 發(fā)生炎癥的時候，局部血管通透性增強，導致更多的免疫細胞到達炎癥部位。因為血流減慢，炎癥細胞和抗原耗氧量增加導致炎癥部位形成局部低氧環(huán)境。在關節(jié)炎、動脈硬化和自身免疫性疾病患者的相應炎癥部位都發(fā)現(xiàn)了低氧環(huán)境和HIF的激活［40］。免疫細胞對低氧的應答和 NF-κB信號通路密切相關。在巨噬細胞、中性粒細胞和一些非免疫細胞中發(fā)現(xiàn)，HIF可以激活NF-κB［40］。低氧可以抑制 PHD1的活性，導致IKK的激活，進而磷酸化IκB，解離出的NF-κB導致下游基因的轉錄激活，如炎癥因子［41］。在巨噬細胞中NF-κB直接調節(jié)HIF-1α的轉錄。缺乏IKK的巨噬細胞即使在低氧下也不能形成穩(wěn)定的HIF-1α蛋白，但是，只有NF-κB的激活同樣不能使HIF-1α穩(wěn)定，這些結果顯示，HIF-1α的激活需要NF-κB和低氧的共同調節(jié)。而HIF-2α 在低氧下的激活則不需要 IKK［42］。缺乏HIF-1的巨噬細胞表現(xiàn)出遷移能力降低，吞噬細菌能力減弱，炎性細胞因子的分泌降低。

3.6 HIF-1在機體系統(tǒng)性低氧中的作用 除了上述病理狀態(tài)下的低氧或缺氧，HIFα在機體的生理低氧狀態(tài)中也發(fā)揮重要作用，如進入高原或者劇烈運動后，造血器官通過增加紅細胞數(shù)目來增加血液的攜氧能力，而這個過程是由HIFα的靶基因EPO所介導的［43-44］。人和小鼠上的研究表明，成年個體EPO水平和造血能力受PHD-2/VHL/HIF-2α通路調節(jié)。家族性紅細胞增多癥是一種血紅蛋白和紅細胞異常增多的遺傳病，研究表明，這種疾病是由于VHL發(fā)生突變使HIF-1α不能在常氧下降解，從而激活EPO導致的［44］。最近，關于世居高原的藏族人和漢族人的基因組研究發(fā)現(xiàn)了PHD-2/VHL/HIF-2α 通路的進化［45-47］，等位基因 SNP的顯著差異發(fā)生在PHD-2和HIF-2α基因上，或者是靠近這些基因的位置。由此推測，藏族人的PHD-2和HIF-2α受到青藏高原物理環(huán)境的選擇壓力而產(chǎn)生了突變，賦予藏人適應青藏高原的能力。最直接的表現(xiàn)就是藏族人對慢性高原病有強的抵抗力，而慢性高原病的發(fā)生與低氧靶基因EPO介導的造血能力提高有關。青藏高原動物和實驗動物小鼠的比較研究發(fā)現(xiàn)，低氧激活小鼠肝臟HIF-1α高表達，但沒有激活高原屬兔和根田鼠肝臟HIF-1α表達，而低氧靶基因IGF-1、IGFBP-1和LDH轉錄展示出“多模式化”調節(jié)方式［48］，高原動物青海湖裸鯉HIF-1α進化速率分析發(fā)現(xiàn)，低溫因素對HIF-1α進化的影響大于低氧因素對其影響，其靶基因Glut1的轉錄受低氧調節(jié)，表現(xiàn)出組織特異性差異，在低氧下腦和肝臟Glut1 mRNA表達明顯比肌肉和心臟低［49］。

圖1 低氧信號通路和Notch、Myc信號通路的交叉調節(jié)Fig.1 Hypoxia signaling pathways crosstalk with Notch and Myc pathways

4 HIF信號通路和其它信號通路的相互調節(jié)

信號通路的相互調節(jié)是當前研究的熱點，也是細胞對不同的外部信號應答的重要方式。研究表明，Myc和Notch信號通路對低氧反應通路有調節(jié)作用(圖1)。Myc轉錄因子家族在細胞生長、分化、凋亡和代謝中有關鍵作用。Myc基因的過度表達促進腫瘤細胞的轉化和增殖［50］。Myc和細胞低氧反應的相互調節(jié)通路至少有3條。首先，低氧激活HIF-1α后通過下調Myc靶基因抑制 Myc，導致細胞周期停滯［51］。第二，HIF-1α參與低氧抑制的細胞周期及DNA修復相關的基因表達，通過在Myc激活的啟動子區(qū)競爭MYC的結合位點，從而抑制MYC的反式激活［52］。第三，低氧依賴的MXI1激活可能負性調節(jié)MYC［53］。MXI1是一個潛在的腫瘤抑制因子，通過與轉錄抑制蛋白及MYC的伴侶分子MAX相互作用來抑制MYC，從而抑制MYC-MAX異二聚體復合物表達。HIF-1α和HIF-2α都可以誘導MXI1抑制MYC的活性。HIF-2α還可以與MAX作用，激活MYC基因的轉錄活性，從而促進細胞的生長［33］。

低氧的細胞反應和Notch通路的相互調節(jié)同樣復雜，并且存在于多個層次。首先，低氧通過上調Notch配體DLL1和DLL4轉錄水平，增強Notch信號［54］。其次，HIF-1α 和 Notch胞內結構域(Notch ICD)之間可以發(fā)生直接作用。HIF-1α被募集到Notch ICD的轉錄復合物上，結合Notch相應的啟動子來激活Notch靶基因［52］。HIF-1α和 Notch ICD的相互作用可能是低氧穩(wěn)定Notch ICD的基礎。第三，F(xiàn)IH-1不僅使HIF-1α羥基化也使Notch ICD羥基化［55］。FIH-1抑制 Notch信號，相比于 HIF-1α，F(xiàn)IH-1更容易與Notch ICD結合，因此影響了FIH-1介導的 HIF-1α 轉錄活性的抑制［56］。

綜上所述，低氧可以出現(xiàn)在很多生理和病理過程中，HIF-1在細胞、組織和器官的低氧損傷和適應過程中有關鍵的調控作用。目前很多研究針對HIF-1蛋白穩(wěn)定性的調節(jié)，關于HIF-α蛋白質翻譯后修飾如何影響DNA結合、轉錄以及與其它相關蛋白間的相互作用，以及低氧信號轉錄的精確過程尚待進一步研究。

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