陳 智

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病研究所、傳染病診治國家重點實驗室，浙江杭州310003)

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是引起慢性肝病的主要原因之一，全球約有HCV感染者1.7億人。HCV感染后，約50% ～85%的感染者不能有效清除病毒而發(fā)展為慢性丙型肝炎，其中20% ～30%發(fā)展為肝硬化，1% ～5%轉(zhuǎn)為肝細胞肝癌(HCC)，嚴重危害人類健康［1］。目前，國內(nèi)外尚無能夠有效預(yù)防HCV感染的疫苗問世。臨床上對丙型肝炎推薦采用聚乙二醇長效α-干擾素(Peg-IFN-α)聯(lián)合利巴韋林(Ribavirin)進行治療，其療效與病毒基因型和宿主基因多態(tài)性(如IL-28B位點)密切相關(guān)［2］。HCV基因1型患者經(jīng)該方案治療1年后，仍有約一半的患者不能產(chǎn)生持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(sustained virological response，SVR)［3］。最近雖然用小分子物質(zhì)如Telaprevir+標準RGT方案進行治療，療效有所提高，但仍有不少問題需要進一步解決。因此，研究其相關(guān)的機制，選擇合理的藥物靶點，對研發(fā)新的高效抗病毒藥物具有十分重要的意義。

近年來，HCV假病毒顆粒(HCV pseudotype particles，HCVpp)［4］及 HCV 細 胞 培 養(yǎng) 體 系(HCV grown in cell culture，HCVcc)［5］的建立，大大推動了對HCV生命周期和生物學(xué)基礎(chǔ)的認識。一系列治療新靶點的發(fā)現(xiàn)，衍生出利用這些新型病毒酶抑制劑、免疫調(diào)節(jié)分子、抗體、反義RNA和治療性疫苗的丙型肝炎治療新策略，以及微小 RNA(microRNAs，miRNAs)調(diào)節(jié)HCV復(fù)制的功能［6-9］，均成為研究者關(guān)注的熱點。

1 miRNA與丙型肝炎發(fā)病機制

越來越多的研究顯示，miRNA與病毒感染的過程密切相關(guān)。首先，丙型肝炎患者肝臟中有多種 miRNAs表達異常。Peng等運用miRNA芯片技術(shù)對丙型肝炎患者肝組織和正常肝組織的miRNA表達水平進行了比較分析，發(fā)現(xiàn)，前者 miR-122、miR-320、miR-193、miR-181、miR-296等miRNA表達下調(diào)，而miR-215、miR-16、miR-26、miR-130、miR-199、miR-155 等的表達上調(diào)，認為這些miRNA可能與HCV感染及丙型肝炎的發(fā)展具有密切關(guān)系［10］。Grek等人和Bihrer等人的臨床研究分別顯示，丙型肝炎患者的外周血單個核細胞(PBMC)和血清中也存在多種miRNAs的異常表達［11-12］。魯兗等人基于Huh-7.5.1細胞HCV感染模型的研究發(fā)現(xiàn)，有13種 miRNAs(miR-10a、miR-149、miR-181a、miR-193a-3p、miR-200b、miR-210、miR-301b、miR-340、miR-365、miR-425、miR-616和miR-629及miR-99b)在HCV感染后表達上調(diào)，而有7種 miRNAs(miR-100、miR-140-5p、miR-148a、miR-152、miR-21 和 miR-27a及 miR-339-5p)則在HCV感染后表達下調(diào)，提示這些差異表達的miRNAs可能也與HCV的復(fù)制相關(guān)［13］。

這些微小RNA的表達變化與丙型肝炎病毒的復(fù)制水平以及丙型肝炎發(fā)病機制有較為密切的關(guān)系。例如，miR-122是肝臟特異性的miRNA，由肝控制區(qū)基因非編碼區(qū)(hcr)轉(zhuǎn)錄加工而成，在肝臟發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，約占整個肝臟表達的 miRNA總量的70%［14］。通過與 HCV 5＇-NCR 的兩個靶位點相結(jié)合，miR-122可上調(diào)HCV復(fù)制水平，是最早發(fā)現(xiàn)的與HCV復(fù)制相關(guān)的宿主miRNA［15］。而朱蕾等人的研究發(fā)現(xiàn)，miR-122可調(diào)節(jié)乙型肝炎病毒抗原表達，并可能潛在地影響HBV發(fā)病機制［16］。Banaudha等人發(fā)現(xiàn) miR-141也能促進HCV復(fù)制，同時miR-141能沉默腫瘤抑制分子DLC-1，因此，miR-141可能與HCV感染導(dǎo)致HCC發(fā)生有關(guān)［17］。Ishida等人的研究顯示，miR-192/miR-215和miR-491與HCV的復(fù)制相關(guān)，miR-491通過PI3K/Akt途徑影響HCV的復(fù)制［18］。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，miR-196和 miR-199a能抑制HCV-1b或-2a復(fù)制子細胞模型中HCV 的復(fù)制［19-20］。

2 miRNA與丙型肝炎靶向治療

鑒于miR-122和miR-141等對HCV復(fù)制有正調(diào)控作用，有望在臨床上開發(fā)出針對HCV感染的miRNA靶向治療策略。我們可通過傳統(tǒng)的反義技術(shù)來抑制miR-122功能，但傳統(tǒng)反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASO)效率低下，因此常需借助體外修飾，如2＇-O-甲基化 (2＇-OMe)、 MOE (2＇-O-methoxyethyl phosphorothioate)、肽核酸 (peptidenucleic acids，PNA)或 2＇-Fluoro/2＇-OMe 嵌合修飾來提高其效率［21-24］。鎖核酸(Locked nucleic acid，LNA)修飾是最新的一種手段。研究發(fā)現(xiàn)，對HCV感染的黑猩猩輸注LNA-antimiR或SPC3649(miR-122的互補LNA-修飾核苷酸)后，其肝細胞可攝入LNA-antimiR或SPC3649而抑制miR-122功能，進而抑制HCV復(fù)制，同時并未發(fā)現(xiàn)明顯的副作用［25-26］。相反，已知miR-199a和miR-196能抑制HCV的復(fù)制，因此過表達miR-199a或miR-196也可作為一種臨床策略。

3 miRNA作為丙型肝炎臨床診治和預(yù)警監(jiān)測指標的意義

Marquez等人對丙型肝炎患者肝組織和正常肝組織的miR-122、miR-21表達水平，與臨床指標進行了關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)miR-21表達水平與病毒滴度、纖維化程度和血清ALT、AST水平呈正相關(guān)，而miR-122表達水平與纖維化程度和血 清 ALT、 AST 水 平 呈 負 相 關(guān)［27］。Bandyopadhyay等人發(fā)現(xiàn)，丙型肝炎患者肝組織中miR-29的表達下調(diào)，而miR-29可抑制肝星狀細胞(HSC)的增殖和分泌膠原，因此，miR-29可能與慢性丙型肝炎患者的纖維化進程相關(guān)［28］。另有報道，慢性丙型肝炎患者的PBMC中miRNA-155和miRNA-196b表達水平與HCV RNA載量相關(guān)［9］。血清中 miR-122表達水平與丙型肝炎患者血清ALT指標和炎癥活動度呈正相關(guān)［10］。

上述研究結(jié)果顯示，丙型肝炎患者較之健康人，其肝臟、PBMC和血清中存在多種microRNAs的表達差異，尤其是其血清或PBMC中的差異miRNAs，有望作為丙型肝炎病情進展和肝硬化的新型預(yù)警及監(jiān)測指標。

4 miRNA作為丙型肝炎抗病毒治療預(yù)后評價指標的意義

最近的幾項臨床研究顯示，miRNAs與丙型肝炎患者的干擾素(IFN)治療應(yīng)答也存在一定關(guān)聯(lián)。Sarasin-Filipowicz等人的研究表明，miR-122的表達在IFN-α難治型HCV患者的肝臟中明顯下調(diào)［29］。Murakami等人發(fā)現(xiàn)，IFN治療后獲得SVR的患者與無應(yīng)答(non-responder，NR)的患者相比，肝臟中 9種miRNAs的表達水平有明顯不同，其中，4種miRNAs(miR-27b、miR-378、miR-422b和 miR-122)的表達水平SVR組要明顯高于NR組，而另外 5 種 miRNAs(miR-34b、miR-145、miR-143、miR-652和miR-18a)的表達水平SVR組要顯著低于NR組［30］。Scagnolari等人的研究發(fā)現(xiàn)，健康志愿者和慢性丙型肝炎患者的PBMC在體外經(jīng) IFN刺激后，miR-1、miR-30、miR-128、miR-196和 miR-296的表達均上調(diào)，但其上調(diào)程度兩組間有差異，而且這5種miRNAs的上調(diào)比例在 SVR組中要高于 NR組［31］。根據(jù)序列預(yù)測分析，這5種 miRNAs在HCV基因組中均有靶點［32］。魯兗等人進一步對HCV感染細胞模型加干擾素干預(yù)后的mi-RNA表達譜進行了分析，發(fā)現(xiàn)13種miRNAs在HCV感染后表達上調(diào)，但在干擾素干預(yù)后出現(xiàn)下調(diào);而另外7種miRNAs在HCV感染后表達下調(diào)，而在干擾素干預(yù)后發(fā)生上調(diào)，提示這些差異表達的miRNAs可能也與丙型肝炎患者IFN應(yīng)答相關(guān)［11］。另外，李蘇娟等研究了miR-122對IFN-α抗HCV效應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)在HCV細胞感染模型中，miR-122模擬物呈劑量依賴性促進HCV RNA復(fù)制，而IFN-α的抗病毒效應(yīng)與HCV載量呈反比，顯示miR-122可能通過影響HCV載量而影響IFN-α的抗HCV效應(yīng)［33］。

上述研究結(jié)果顯示，miRNAs在IFN應(yīng)答和無應(yīng)答患者間存在差異，聯(lián)合分析某些特異的miRNAs，有望作為丙型肝炎患者抗病毒治療效果的一種新型的預(yù)后評價指標。

5 miRNA研究中存在問題與研究方向

綜上所述，miRNAs的表達失調(diào)與丙型肝炎的病毒感染及疾病進展密切相關(guān)，因此，研究基于miRNA調(diào)控的HCV臨床治療新策略具有十分重要的意義。然而，由于一種miRNA能調(diào)控多種靶基因，miRNA的生物學(xué)功能常不能僅從其單一靶基因作出推斷。雖然miRNAs靶基因可通過計算機模擬分析來確定，但該技術(shù)也僅能預(yù)測約50%的調(diào)控靶點。另外，miRNAs能通過聯(lián)合調(diào)控一系列靶點，而影響某種特定表型，即表型常由多個靶點來共同調(diào)控。miRNAs對單個mRNAs靶點的調(diào)控效應(yīng)是部分的，而多個靶點的共同調(diào)節(jié)會產(chǎn)生協(xié)同的表型改變。因此，當miRNA應(yīng)用于臨床時，其靶點的選擇和其他宿主因素尚需慎重考慮。

目前，miR-122的抑制物已進入I期臨床研究階段，有望成為第一種基于miRNA的臨床治療策略，但其安全性和有效性正在作進一步臨床觀察。同時，對于這種特殊小分子的合理選擇和有效修飾及高效運輸?shù)确矫妫€有待進一步深入研究。隨著對miRNAs研究的深入，一些以miRNA為靶點的試劑和新藥將不斷涌現(xiàn)，從而開辟對丙型肝炎臨床診斷和治療的新領(lǐng)域。

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