崔巍，王春梅，李慶章，馮麗，丁巍

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱150030)

miR-126對小鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖及泌乳功能的影響

崔巍，王春梅，李慶章，馮麗，丁巍

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱150030)

應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，改變miR-126在小鼠乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)量，采用qRT-PCR、HPLC、Western印跡等技術(shù)檢測miR-126對小鼠乳腺上皮細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，miR-126沉寂后，細(xì)胞增殖能力提高，β-酪蛋白表達(dá)增加，乳糖質(zhì)量濃度增加，孕酮受體（PGR）表達(dá)增強。研究表明，miR-126可能通過抑制靶蛋白PGR表達(dá)，進(jìn)而抑制乳腺上皮細(xì)胞增殖和泌乳量變化。

微小RNA；miR-126；孕酮受體（PGR）；基因沉寂

0 引言

一類通過翻譯抑制調(diào)控基因表達(dá)的非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)，開啟了哺乳動物細(xì)胞一種新的基因調(diào)控途徑。包括人類的發(fā)育和衰老、神經(jīng)疾病和癌癥的治療[1]。有研究證明miR-126與抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[2]及轉(zhuǎn)移[3]有關(guān)。應(yīng)用微陣列已分析出miR-126在小鼠乳腺生長發(fā)育不同時期表達(dá)差異，可能參與乳腺發(fā)育的調(diào)控[4]。利用miRBase方法預(yù)測分析，小鼠孕酮受體（progestrone receptor,PGR）mRNA存在與miR-126結(jié)合位點。為進(jìn)一步闡釋miR-126作用機制，本文擬從不同發(fā)育時期乳腺組織中鑒定miR-126差異性，對miR-126沉寂，在細(xì)胞水平檢測PGR變化及對小鼠乳腺細(xì)胞發(fā)育及泌乳功能的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

雌性BALB/C小白鼠。X-tremeGene SiRNA Transfection Reagent；miR-126-3p inhibitor，Negative Control(N.C)，Hairpin-itTM microRNA qPCR Quantitation Kit，Trizol，Opti-MEM I medium，PGR多克隆抗體，GAPDH多克隆抗體，細(xì)胞角蛋白18抗體，SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ，辣根酶標(biāo)記IgG，F(xiàn)ITC二抗，ECL超敏發(fā)光液，CASY-ton緩沖液。

1.2 小鼠乳腺不同發(fā)育時期miR-126表達(dá)譜

針對小鼠不同發(fā)育時期乳腺組織，具體時間點進(jìn)行取材，采用熒光定量的方法對小鼠乳腺發(fā)育、泌乳及退化中miR-126進(jìn)行相對定量分析，同時驗證基因芯片的結(jié)果。miR-126 RTprimer和PCR擴增引物均由上海吉瑪公司合成。取不同時間點小鼠乳腺組織，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄條件：16℃（30 min），42℃（30 min），85℃（10 min）。應(yīng)用ABI 7500PCR儀，PCR條件：95℃（3 min），95℃（12 s），62℃（30 s）,40個循環(huán)。以5 s為內(nèi)參。

1.3 小鼠乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

取妊娠中期雌鼠乳腺組織，用胰蛋白酶37℃消化，再用I型膠原酶37℃繼續(xù)消化，所得乳腺上皮細(xì)胞沉淀接種培養(yǎng)瓶中，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞角蛋白18免疫熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞角蛋白18的特異性表達(dá)[5]。

1.4 小鼠乳腺上皮細(xì)胞的瞬時轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的小鼠乳腺上皮細(xì)胞，用培養(yǎng)基將其濃度調(diào)整為1.0×104細(xì)胞/mL，接種于培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到80%左右時，用miR-126 inhibitor和Negative Control分別轉(zhuǎn)染小鼠乳腺上皮細(xì)胞，具體操作參見X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent說明書。實驗分組如下：轉(zhuǎn)染組：miR-126 inhibitor+X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent；陰性對照組：Negative Control+X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent；空白組。

1.5 小鼠乳腺上皮細(xì)胞活性測定

用X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實驗同1.4轉(zhuǎn)染和陰性對照組，每組設(shè)3個平行，轉(zhuǎn)染48 h后，消化收集各組細(xì)胞，CASY-ton緩沖液1︰100稀釋后用CASY細(xì)胞分析儀檢測活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力。

1.6 檢測轉(zhuǎn)然后細(xì)胞內(nèi)miR-126相對變化

實驗同1.4，分轉(zhuǎn)染組和陰性對照組，每組3個平行，48 h后收獲細(xì)胞，提取細(xì)胞中總RNA，應(yīng)用qRTPCR技術(shù)檢測miR-126的表達(dá)變化。

1.7 Westernblotting檢測PGR蛋白

實驗同1.4分，分3組，轉(zhuǎn)染48 h后，分別收集以上各組小鼠乳腺上皮細(xì)胞，用2×SDS上樣緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行8%SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜，一抗為兔抗鼠PGR多克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯示蛋白質(zhì)表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行光密度分析。

Western blotting檢測β-酪蛋白變化，實驗同1.7。

1.8 HPLC檢測乳糖質(zhì)量濃度

實驗分2組：轉(zhuǎn)染組和陰性對照組，每組設(shè)3個平行，收集48 h的樣品；色譜柱，十八烷基硅烷鍵合硅膠，F(xiàn)4.6 mm×150 mm；柱溫，室溫；紫外檢測波長，195 nm；流動相，5%乙腈，經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾，超聲脫氣；流速，恒流0.6 mL/min；進(jìn)樣體積，10 μL。在同等條件下進(jìn)行乳糖標(biāo)準(zhǔn)品的測定。

1.9 數(shù)據(jù)處理

熒光定量PCR的結(jié)果以Ct值顯示，采用ΔΔCT法分析，計算相對定量結(jié)果（2-ΔΔCT）。采用SPSS13.0軟件對相關(guān)實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行t-檢驗分析，BandScand4.3軟件對Western blotting圖譜進(jìn)行灰度掃描。

2 結(jié)果

2.1 不同發(fā)育時期小鼠乳腺組織miR-126表達(dá)譜

分別取青春4、5、7周，妊娠5、13、18日，泌乳3、7、13日、退化期2、5、10日乳腺組織，提取總RNA，甲醛變性電泳檢測鑒定各時間點RNA質(zhì)量，以逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板PCR，分別擴增miR-126和內(nèi)參5 s，得出表達(dá)結(jié)果。miR-126在泌乳期相對變化較低（P＜0.01），其次是妊娠期（P＜0.01），青春7周相對變化最高（P＜0.01，圖1）。

圖1 qRT-PCR檢測小鼠乳腺中miR-126的表達(dá)

圖1中，依次為青春4周、5周、7周；妊娠5日、13日、18日；泌乳3日、7日、13日；退化2日、5日、10日。

2.2 抑制劑對內(nèi)源miR-126表達(dá)影響

miR-126 inhibitor轉(zhuǎn)染48 h后，經(jīng)qRT-PCR檢測，比較轉(zhuǎn)染組、陰性對照組中miR-126的表達(dá)變化，結(jié)果顯示miR-126在轉(zhuǎn)染組表達(dá)量較陰性對照組顯著降低（P＜0.01，圖2）。

圖2 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-126表達(dá)

由圖2可以看出，miR-126 inhibitor作用后內(nèi)源性miR-126表達(dá)量顯著減少，P＜0.01。

2.3 轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞活力的影響

miR-126 inhibitor轉(zhuǎn)染48 h后，CASY細(xì)胞分析儀分析小鼠乳腺上皮細(xì)胞活性，轉(zhuǎn)染組小鼠乳腺上皮細(xì)胞活性高于陰性對照組（P＜0.05，如表1），且差異顯著，說明miR-126可抑制小鼠乳腺上皮細(xì)胞活性。

表1 miR-126 inhibitor作用后小鼠乳腺上皮細(xì)胞活性變化

2.4 轉(zhuǎn)染后PGR蛋白表達(dá)變化

Western blotting技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染組、陰性對照組和空白對照組小鼠腺上皮細(xì)胞中PGR蛋白表達(dá)的變化情況。結(jié)果顯示在miR-126 inhibitor的作用下，小鼠乳腺上皮細(xì)胞中PGR蛋白的表達(dá)高于陰性對照組和空白對照組（P＜0.05，圖3），說明miR-126可抑制小鼠乳腺細(xì)胞中PGR蛋白的表達(dá)。

圖3(a)中，1為空白對照組；2為陰性對照組；3為抑制組；用miR-126 inhibitor和negative control分別轉(zhuǎn)染小鼠乳腺上皮細(xì)胞；轉(zhuǎn)染48 h后，應(yīng)用Western blotting檢測PGR蛋白的表達(dá)。圖3(b)中，灰度掃描分析PGR的表達(dá)；通過3個平行實驗獲得實驗數(shù)據(jù)；結(jié)果顯示抑制組顯著高于陰性對照組和空白對照組（means±SE,P＜0.05）。

圖轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)變化

2.5 轉(zhuǎn)染后β-酪蛋白表達(dá)變化

Western blotting技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染組、陰性對照組和空白對照組小鼠腺上皮細(xì)胞中β-酪蛋白表達(dá)的變化情況。結(jié)果顯示在miR-126 inhibitor的作用下，小鼠乳上皮細(xì)胞中β-酪蛋白的表達(dá)顯著高于陰性對照組和空白對照組（P＜0.01，如圖4），說明miR-126可抑制小鼠乳腺細(xì)胞中β-酪蛋白的表達(dá)。

圖4 轉(zhuǎn)染后β-酪蛋白的變化

圖4（a)中，1為抑制組；2為空白組；3為陰性對照組；用miR-126 inhibitor和negative control分別轉(zhuǎn)染小鼠乳腺上皮細(xì)胞；轉(zhuǎn)染48 h后，應(yīng)用Western blotting檢測β-酪蛋白的表達(dá)。圖4(b)中，灰度掃描分析β-酪蛋白的表達(dá)；通過3個平行實驗獲得實驗數(shù)據(jù)；結(jié)果顯示抑制組顯著高于陰性對照組和空白對照組（means±SE,P＜0.01）。

2.6 轉(zhuǎn)染后乳糖質(zhì)量濃度變化

根據(jù)乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，并比較陰性對照組，結(jié)果顯示，miR-126 inhibitor轉(zhuǎn)染后乳糖質(zhì)量濃度增加（P＜0.05，如圖5），說明miR-126可抑制小鼠乳腺上皮細(xì)胞乳糖的分泌。

圖5 轉(zhuǎn)染后乳腺上皮細(xì)胞乳糖分泌變化

3 討論

內(nèi)含子miRNA代表著一種新的研究領(lǐng)域，在細(xì)胞系、斑馬魚、小鼠皮膚中內(nèi)含子miRNA誘導(dǎo)的基因沉默證明，這種內(nèi)含子介導(dǎo)的基因調(diào)控系統(tǒng)在真核生物中是高度保守的[1]。目前對miRNA功能研究主要集中在基因的調(diào)控和細(xì)胞發(fā)育及分化上。越來越多的證據(jù)顯示，miRNA的失調(diào)與癌癥相關(guān)[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-126可以通過抑制腫塊的生長，從而抑制高侵襲性乳腺癌細(xì)胞CN34的轉(zhuǎn)移[3]。有試驗表明，miR-126是通過抑制細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，從而抑制了細(xì)胞的增殖[9]。在乳腺發(fā)育及泌乳的研究中發(fā)現(xiàn)，孕酮受體（PGR）基因僅在乳腺上皮組織中表達(dá)[10]，其表達(dá)調(diào)控也屬于組織特異性激素調(diào)控[11]。PGR都存在A、B兩種亞型，由同一基因編碼，在沒有懷孕和已經(jīng)懷孕的成年小鼠乳腺中，PGR-A蛋白的表達(dá)水平超過PGR-B[12]。

本實驗應(yīng)用生物信息學(xué)、微陣列分析及熒光定量實驗分析得出，miR-126結(jié)合靶基因PGR mRNA并進(jìn)行調(diào)控，同時對小鼠乳腺上皮細(xì)胞的增殖和泌乳有著一定的抑制作用，并在翻譯水平上影響靶蛋白，這為進(jìn)一步研究miRNA在乳腺發(fā)育及泌乳功能方面的作用提供了一定的實驗依據(jù)。

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Impact of miR-126 on proliferation and lactation of Mouse mammary epithelial cells

CUI Wei,WANG Chun-mei,LI Qing-zhang,FENG Li,DING Wei
(Key Laboratory of Dairy Science of Education Ministry,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In this study,liposome transfection techniqueswere used to change the expression of miR-126 in mouse mammary epithelial cells.The effect of miR-126 on mouse mammary epithelial cells was analyzed by qRT-PCR,HPLC,Western blotting.The results showed that,after miR-126 silence cell proliferation ability enhanced,beta casein expression increased,lactose content increased,progesterone receptor(PGR)expression enhanced.The results suggest that miR-126 probably inhibit mammary epithelial cells and lactation by suppressing expression of PGR.

microRNA;miR-126;progestrone receptor;gene silencing

Q936

A

1001-2230（2011）03-0017-03

2010-12-13

國家自然科學(xué)基金（No.31072103）。

崔巍（1985-），女，碩士研究生，研究方向為乳腺發(fā)育與泌乳功能調(diào)控。

李慶章