李紅娟，劉鷺，張書文，孫卓，2，孔凡丕，呂加平

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，山東青島266109）

抗真菌乳酸菌的篩選鑒定及發(fā)酵特性

李紅娟1，劉鷺1，張書文1，孫卓1，2，孔凡丕1，呂加平1

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，山東青島266109）

利用瓊脂擴(kuò)散法，對60株從傳統(tǒng)乳酸菌發(fā)酵食品分離出來的乳酸菌進(jìn)行抗真菌特性的篩選，得到一株抑菌性能較好的乳酸菌菌株AST18，經(jīng)16s rDNA鑒定為干酪乳桿菌Lactobacillus casei，并進(jìn)一步對AST18發(fā)酵特性進(jìn)行研究，研究表明AST18最適生長溫度為37℃，培養(yǎng)基最適初始pH值為6.5，培養(yǎng)48 h以后抑菌物質(zhì)生成量達(dá)到穩(wěn)定。

抗真菌；乳酸菌；干酪乳桿菌；16s rDNA

0 引言

乳酸菌用在食品和飼料中有著悠久的歷史，它可以降低食品pH值并產(chǎn)生抑菌的代謝物質(zhì),如對革蘭氏陽性菌有良好抑制作用的乳酸鏈球菌素。近幾年，國外許多研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌對霉菌和酵母也有一定的抑菌功能，篩選出具有良好抑真菌性能的乳酸菌，并將其應(yīng)用到食品中，有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

本研究從中國傳統(tǒng)發(fā)酵制品中分離出的乳酸菌中篩選出一株具有較好抑真菌作用的菌株AST18，經(jīng)16s rDNA鑒定為干酪乳桿菌。并對該菌抗菌物質(zhì)生成的發(fā)酵特性進(jìn)行了研究，為抗真菌乳酸菌發(fā)酵劑研究開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培養(yǎng)基

本研究中，所用乳酸菌菌株分離自東北泡菜及酸奶，指示菌Penicilliumsp.、momursp.、兩株腐敗酵母均分離自霉變干酪，啤酒酵母YS-1,YS-2,YS-3,YS-4,YS-5,YS-6,YS-7為本實(shí)驗(yàn)室提供，以上菌種均保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品微生物實(shí)驗(yàn)室。

培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基。

1.1.2 乳酸菌無菌體發(fā)酵液制備

按2%的接種量，將活化后的乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h，經(jīng)離心(4 000 g，10 min)收集上清液。將上清液用0.22 μm無菌濾膜過濾。

1.1.3 霉菌孢子懸浮液制備

將Penicilliumsp.于PDA斜面培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)7 d，直至孢子生成。用含有體積分?jǐn)?shù)為0.05%吐溫-80的無菌水沖洗斜面，用無菌紗布過濾，并利用血球計(jì)數(shù)板將孢子濃度調(diào)制為106mL-1。

1.2 方法

1.2.1 瓊脂平板擴(kuò)散法測定抑菌能力

將20 mL PDA培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿中，待凝固后將100 L制備好的霉菌孢子懸浮液涂布于培養(yǎng)基上，將牛津杯（直徑8mm）輕置于平板上，靜置5 min后取200 L無菌體發(fā)酵液注入牛津杯中。30℃培養(yǎng)2 d，測定抑菌圈直徑[1]。

1.2.2 16S rDNA序列同源性鑒定乳酸菌菌株AST18

單菌落培養(yǎng)：將脫脂乳保存的菌種接于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h，在MRS瓊脂平板中劃線培養(yǎng)，使其長出單菌落。

變性：在MRS瓊脂平板上挑取細(xì)菌于10 μL滅菌水中變性后離心取上清作為模板。反應(yīng)條件為99℃（10 min）。

PCR擴(kuò)增：采用北京天根生化科技有限公司的TIANnamp Bacteria細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取AST18菌株基因組DNA，PCR擴(kuò)增引物為上海寶生物技術(shù)有限公司所提供，引物序列如下：

Primers 16S.S(5_-GGTGTAGCGGGTGAAATGCGAA-3_)

16S.R(5_-CAGCCTACAATCCGAGCTGAG-3_)

使用TaKaRa 16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.D310)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。

PCR反應(yīng)條件：PCR產(chǎn)物檢測及純化：預(yù)先制備1.0%的瓊脂糖凝膠，擴(kuò)增反應(yīng)完畢后，取5 μL的PCR產(chǎn)物與1 μL 6×Loading buffer混合，加樣于瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中進(jìn)行電泳，電壓5 V/cm。電泳后，用溴化乙錠染色20～30 min，紫外燈下觀察。如果PCR成功，則可見到約為1 500 bp的條帶。采用寶生物公司的切膠回收試劑盒(TaKaRa Code：DV805A)純化回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物[2]。

測序：以上述序列為引物進(jìn)行DNA測序。測序結(jié)果應(yīng)用于BLAST程序與美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的細(xì)菌16s rDNA序列進(jìn)行相似性比較分析。

1.2.3 AST18抗菌物質(zhì)生成發(fā)酵特性

（1）培養(yǎng)基初始pH值對抑菌物質(zhì)生成的影響：用濃度為1 mol/L的HCl和NaOH將MRS肉湯培養(yǎng)基的初始pH值分別調(diào)至4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0。按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%接種量接種，37℃培養(yǎng)48 h后觀測抑菌圈大小、pH值及OD值[3]。

（2）培養(yǎng)溫度對抑菌物質(zhì)生成的影響：將初始pH值為6.5的MRS肉湯培養(yǎng)基按2%接種量分別在30，37及42℃培養(yǎng)48 h后，觀測抑菌圈大小、pH值及OD值。

（3）通氣條件對抑菌物質(zhì)生成的影響：用250 mL錐形瓶37℃加不通氣丁基橡膠膠塞靜置培養(yǎng)，棉塞靜置培養(yǎng)，棉塞搖床培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速130 r/min)，48 h觀測pH值、OD值及抑菌活性[1]。

（4）最佳發(fā)酵時(shí)間的選擇：將初始pH值為6.5的MRS肉湯培養(yǎng)基按2%接種量37℃恒溫靜置培養(yǎng)，在0，6，8，12，24，36，48，60，72 h測定抑菌圈大小、pH值及OD值。

2 結(jié)果分析

2.1 抗真菌乳酸菌的篩選

60株乳酸菌中有7株對Penicilliumsp.和momursp.同時(shí)顯示出抑菌活性，Penicilliumsp.對乳酸菌發(fā)酵液相對momursp.敏感，定為試驗(yàn)指示菌。7株菌對從干酪中分得的腐敗酵母及啤酒酵母均無抑制作用。其中AST18顯示出最大抑菌活性，抑菌圈直徑達(dá)20.83 mm。

表1 不同菌株48 h發(fā)酵液抑菌直徑、OD值、pH值

2.2 AST18菌株16S rDNA序列同源性鑒定

PCR反應(yīng)產(chǎn)物的檢測與序列鑒定：預(yù)先制備1.0%的瓊脂糖凝膠，擴(kuò)增反應(yīng)完畢后，取5 μL的PCR產(chǎn)物與1 μL 6×Loading buffer混合，加樣于瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中進(jìn)行電泳，電壓5 V/cm。電泳后，用溴化乙錠染色20～30 min，紫外燈下觀察。見到約為1 500 bp的條帶。采用寶生物公司的切膠回收試劑盒(TaKaRa Code：DV805A)純化回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用上述的引物進(jìn)行DNA測序。用BLAST程序與美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的細(xì)菌16s rDNA序列進(jìn)行相似性比較分析。結(jié)果：AST18 1-600核苷酸序列與美國國家菌種保藏中心標(biāo)準(zhǔn)菌株干酪乳桿菌Lactobacillus caseiATCC 334同源性為99%。

2.3 AST18抗菌物質(zhì)生成發(fā)酵特性研究

2.3.1 培養(yǎng)基初始pH值對抑菌物質(zhì)生成的影響

用1 mol/L的HCl和NaOH將MRS肉湯培養(yǎng)基的初始pH值分別調(diào)至4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0。按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%接種量接種，37℃培養(yǎng)48 h后觀測抑菌圈大小、pH值及OD值。結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看出，AST18在培養(yǎng)基初始pH值在6.0～6.5之間，生長狀況良好。且抑菌性能最佳。因此培養(yǎng)基初始pH值選為6.5。

2.3.2 培養(yǎng)溫度對抑菌物質(zhì)生成的影響

圖1 不同初始pH值對OD值及抑菌直徑的影響

將初始pH值為6.5的MRS肉湯培養(yǎng)基按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%接種量分別在30，37及42℃培養(yǎng)48 h后，觀測抑菌圈大小、pH值及OD值，結(jié)果如表2所示。

表2 不同培養(yǎng)溫度的影響

由表2可以看出，AST18抑菌物質(zhì)生成的最適溫度為37℃，當(dāng)溫度升高到42℃時(shí)，AST18生長及抑菌物質(zhì)的生成受到抑制。因此AST18最適生長溫度為37℃。

2.3.3 通氣條件對抑菌物質(zhì)生成的影響

用250 mL錐形瓶37℃加不通氣丁基橡膠膠塞靜置培養(yǎng)，棉塞靜置培養(yǎng)，棉塞搖床培養(yǎng)(100 r/min)，48 h觀測pH值、OD值及抑菌活性，結(jié)果如表3所示。

表3 不同通氣條件的影響

由表3可以看出，在搖床條件下，菌體抗菌代謝產(chǎn)物生成量較高，加不透氣丁基橡膠塞菌AST18生長受抑制。棉塞搖床培養(yǎng)同棉塞靜置培養(yǎng)的抑菌直徑及OD值差異不顯著。

2.3.4 最佳發(fā)酵時(shí)間的選擇

將初始pH值為6.5的MRS肉湯培養(yǎng)基按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%接種量37℃恒溫靜置培養(yǎng)，在0，6，8，12，24，36，48，60，72 h測定抑菌圈大小、pH值及OD值，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，在發(fā)酵初期隨時(shí)間的增加，菌量和抑菌活性都在增加，但在48 h時(shí)，抑菌活性達(dá)到最大值，后期發(fā)酵過程中隨時(shí)間變化不明顯，因此，最佳發(fā)酵時(shí)間選擇48 h。

3 結(jié)論與討論

霉菌和酵母幾乎在任何食品上都可以生長：谷物、水果、蔬菜、堅(jiān)果、乳制品等。O.Filtenborg等認(rèn)為與各食品霉變相關(guān)的霉菌只有少量幾種，大部分屬于青霉、曲霉和鐮刀霉。在酸奶和干酪等發(fā)酵乳制品中經(jīng)常造成污染的霉菌主要是Penicillium commune和P.nalgiovense[4]。目前，生物防腐在延長食品貨架期和加強(qiáng)食品安全方面起到了越來越重要的作用。生物防腐主要是通過自然發(fā)酵、添加發(fā)酵劑、或添加代謝產(chǎn)物來起到防腐保鮮的作用[5]。

乳酸菌自古以來就用于食品發(fā)酵和保藏，現(xiàn)在被視為公認(rèn)安全微生物(GRAS)。許多乳酸菌除產(chǎn)生乳酸、乙酸和雙乙酰等抗菌物質(zhì)外，還可產(chǎn)生一些具有抑菌或殺菌作用的細(xì)菌素，如乳鏈球菌素、片球菌素等，但大多數(shù)細(xì)菌素的抑菌譜較窄，如Nisin主要只對革蘭氏陽性菌有抑制作用。近年來發(fā)現(xiàn)有些乳酸菌能產(chǎn)生另外一些廣譜抗菌物質(zhì)，苯乳酸就是其中之一[6]。

更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)菌株的抗真菌活力不僅僅與產(chǎn)生的有機(jī)酸有關(guān)，更是其它抗菌物質(zhì)的聯(lián)合作用[7]。只有少數(shù)乳酸菌能產(chǎn)生一系列的抗真菌物質(zhì)，而大部分乳酸菌沒有這個(gè)特性。因此推測這些菌株可能具有其獨(dú)特的代謝途徑[8]。

本研究中60株乳酸菌有7株對Penicilliumsp.和momursp.菌顯示出一定程度的抑制活性，對其中抑菌性能最好的菌株AST18進(jìn)行了鑒定，鑒定結(jié)果為干酪乳桿菌。并對其抑菌物質(zhì)生成的發(fā)酵特性進(jìn)行研究，研究表明AST18最適生長溫度為37℃，培養(yǎng)基最適初始pH值為6.5，培養(yǎng)48 h以后抑菌物質(zhì)生成量達(dá)到穩(wěn)定。而對于抑菌物質(zhì)具體活性成分需要進(jìn)一步的研究。

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Screening of antifungalLactic acid bacteriaand the study of fermentation properties

LI Hong-juan1,LIU Lu1,ZHANG Shu-wen1,SUN Zhuo1,2,KONG Fan-pi1,LV Jia-ping1,
（1.Institute of Agro-Food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193 China，2.College of Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109,China）

A total of 60Lactic acid bacteria(LAB)strains isolated from Chinese traditional fermented foods were screened for antifungal activity.The antifungal properties of AST18 which showed the highest antifungal activities among all the 60 strains were investigated.The AST18 was identified asLactobacillus caseiwith the 16s rDNA.The fermentation properties ofLactobacillus caseiAST18 were investigated.The optimum production of antifungal compound was at 37°C for 48 h and at the initial pH of 6.5.

antifungal;Lactic acid bacteria;Lactobacillus casei;16s rDNA

Q939.11+7

A

1001-2230（2011）03-0004-03

2010-12-8

國家“十一五”奶業(yè)科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2006BAD04A07）。

李紅娟（1987-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿槠肺⑸铩?/p>

呂加平