周梅，肖軍，徐藝釗，曾日紅

（中山市嘉丹婷日用品有限公司，廣東 中山 528415）

復(fù)配“三酶一素”抑制劑的美白功效評(píng)價(jià)

周梅，肖軍，徐藝釗，曾日紅

（中山市嘉丹婷日用品有限公司，廣東 中山 528415）

本文用細(xì)胞生物學(xué)法及細(xì)胞圖像分析法對(duì)由光甘草定和MSH復(fù)配的美白劑“三酶一素”抑制劑的美白效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，“三酶一素”抑制劑對(duì)黑色素形成過(guò)程中各個(gè)階段的酶均能起到抑制作用。通過(guò)電鏡觀察，使用“三酶一素”抑制劑可減少黑色素細(xì)胞和黑色素瘤B16細(xì)胞，美白效果明顯。

美白；三酶一素；MSH；光甘草定

近年來(lái)，皮膚美白類化妝品的開發(fā)日趨活躍，銷售快速增長(zhǎng)，美白產(chǎn)品已成為許多愛(ài)美女性必備的化妝品。然而，隨著美白化妝品的廣泛使用，暴露出來(lái)的問(wèn)題也越來(lái)越引人關(guān)注。傳統(tǒng)皮膚美白產(chǎn)品中往往添加了過(guò)氧化氫、氯化銨基汞以及各種酚類衍生物等化合物，其作用機(jī)理是促使黑色素組織迅速瓦解，從而起到快速美白之功效。但這些成分對(duì)皮膚具有腐蝕性、細(xì)胞毒性和過(guò)敏性，長(zhǎng)期使用具有極大的危害性，許多國(guó)家包括我國(guó)均已禁用。

通過(guò)抑制黑色素的合成來(lái)達(dá)到美白效果是當(dāng)今美白產(chǎn)品發(fā)展的方向。目前，熊果苷、曲酸、維生素C以及它們的衍生物等已被廣泛應(yīng)用于美白產(chǎn)品中，取得了一定的效果。但是，上述美白活性成分的滲透率較低，功效不夠理想，配方師往往通過(guò)添加大量美白劑來(lái)增強(qiáng)效果，但仍難以滿足消費(fèi)者的需求。同時(shí)，隨著添加量增大，產(chǎn)生了許多安全隱患。例如，研究表明長(zhǎng)期應(yīng)用曲酸會(huì)引起接觸性皮炎和紅斑反應(yīng)，并可能誘發(fā)婦女乳腺癌，曾在日本和臺(tái)灣地區(qū)引起極大關(guān)注；熊果苷則是通過(guò)釋放氫醌來(lái)達(dá)到美白效果，而后者的細(xì)胞毒性很大，已被禁止應(yīng)用于化妝品中[1,2]。這些成分還容易導(dǎo)致化妝品的質(zhì)量問(wèn)題：熊果苷應(yīng)用于配方中易引起產(chǎn)品變色；曲酸會(huì)與許多金屬離子螯合，特別是鐵離子產(chǎn)生著色的復(fù)合物，與空氣接觸緩慢氧化，在高溫下還能加速。維生素C及其衍生物存在容易氧化或吸收困難等缺點(diǎn)。

為此，研究和開發(fā)安全性好、質(zhì)量穩(wěn)定、能滿足消費(fèi)者功效要求的美白產(chǎn)品，已成為化妝品業(yè)界亟需解決的熱門課題。本文根據(jù)黑色素形成機(jī)理，采用細(xì)胞生物學(xué)法及細(xì)胞圖像分析法，對(duì)由光甘草定和十一碳烯酰苯基丙氨酸（商品名MSH）復(fù)配的美白劑“三酶一素”抑制劑進(jìn)行了美白效果評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 黑色素的形成機(jī)理

正常狀態(tài)下人的膚色取決于黑色素的含量及其分布，美白的核心內(nèi)容就是抑制黑色素的形成[1-2]。黑色素通常包括三種類型：DHI黑色素，DHICA黑色素和P H E O黑色素。D H I黑色素和D H I C A黑色素合稱優(yōu)黑素（Eumelanin），也有人稱為真黑素；P H E O黑色素稱脫黑色素（Pheomelanin），也有人稱為褐黑素。

DHI黑色素是三種色素中顏色最深的一種，呈黑色到暗棕色，其相對(duì)分子質(zhì)量最大，且不溶于酸堿。它由酪氨酸酶催化氧化而來(lái)，是人們通常所講的黑色素。DHICA黑色素的顏色比DHI黑色素稍淺，呈棕色，且相對(duì)分子質(zhì)量也比DHI黑色素小，微溶于酸堿。PHEO黑色素顏色最淺，呈黃色到紅棕色，其相對(duì)分子質(zhì)量最低，可溶于堿。

黑色素形成的生理過(guò)程可基本概括為：黑色素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素；黑色素顆粒通過(guò)黑色素細(xì)胞樹枝狀突起向角朊細(xì)胞轉(zhuǎn)移；轉(zhuǎn)移至角朊細(xì)胞的黑色素顆粒隨表皮細(xì)胞上行至角質(zhì)層，并隨著角質(zhì)層脫落而排泄。其形成機(jī)理[3]如圖1所示。

白種人皮膚含褐黑色素居多，膚色較淺。黃種人的皮膚以優(yōu)黑色素居多，膚色較深，因此其美白的主要途徑是抑制優(yōu)黑色素的形成。研究表明，α-促黑細(xì)胞激素、酪氨酸酶、多巴互變酶（TRP-2）、DHICA氧化酶（TRP-1）（簡(jiǎn)稱“三酶一素”）在黑色素的形成過(guò)程中起著重要的作用[1]，抑制“三酶一素”的生成是實(shí)現(xiàn)美白功能的關(guān)鍵。

1.2 “三酶一素”抑制劑——復(fù)配美白劑的美白機(jī)理

當(dāng)前我國(guó)化妝品市場(chǎng)上的美白劑幾乎都以抑制酪氨酸酶的活性為主。由于抑制機(jī)理單一，再加上活性物的滲透性不理想，使得產(chǎn)品的美白效果較差。而且這些美白劑具有很大的刺激性和致敏性，過(guò)量殘留在皮膚上會(huì)給消費(fèi)者帶來(lái)一些安全隱患。目前，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有一種美白產(chǎn)品利用單一美白劑就能達(dá)到同時(shí)抑制α-促黑細(xì)胞激素、酪氨酸酶、TRP-2和TRP-1的目的，因此多種美白劑復(fù)配使用才能同時(shí)抑制“三酶一素”。MSH和光甘草定（Glabridin）是兩種應(yīng)用于美白化妝品中的最新化合物，本實(shí)驗(yàn)選擇由MSH和光甘草定復(fù)配美白劑。

1.2.1 MSH的美白機(jī)理

MSH是促黑色素細(xì)胞激素α-MSH分子的有效拮抗劑，它作用于因α-MSH引發(fā)的黑色素形成的各個(gè)階段的生化反應(yīng)，從而抑制黑色素的形成。與抑制酪氨酸酶的傳統(tǒng)美白劑（如熊果苷、曲酸等）不同，MSH通過(guò)非抑制酪氨酸酶的途徑來(lái)阻止黑色素的產(chǎn)生，而且與其他美白劑配合使用效果更好。MSH在2%用量?jī)?nèi)是安全無(wú)刺激的，對(duì)光、熱均非常穩(wěn)定，溶于水，可以直接加入到水相中參與乳化[4-6]。

圖1 黑色素的形成機(jī)理

1.2.2 光甘草定的美白機(jī)理

光甘草定（4-[(3R)-8,8-Dimethyl-3,4-dihydro-2H-pyrano [6,5-f]chromen-3-yl]Ben-Zene-1,3- diol）從特定品種的甘草中提取，是目前世界上公認(rèn)最有效的天然美白劑。它能抑制酪氨酸酶的活性，又能抑制多巴色素互變和DHICA氧化酶的活性，是一種快速、高效、綠色的美白祛斑化妝品添加劑，具有與SOD（過(guò)氧化物歧化酶）相似的清除氧自由基的能力，以及與維生素E相近的抗氧自由基能力，還具有抗菌消炎、抗氧化、抗衰老、吸收紫外線、美白亮膚、祛斑的作用。光甘草定目前已在化妝品行業(yè)大量使用，如在膏霜、水、露、乳液等產(chǎn)品中都得到廣泛應(yīng)用[7-9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 用細(xì)胞生物學(xué)法測(cè)試“三酶一素”抑制劑的美白效果

化妝品行業(yè)的研發(fā)專家注意到，MSH與光甘草定在美白方面各自有其獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，兩者的抑制機(jī)理各有不同，但價(jià)格都相當(dāng)昂貴，應(yīng)用起來(lái)成本壓力很大，因而難以推廣。如果將其加以復(fù)配，就能夠發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，從而既能夠增強(qiáng)美白效果，還可以降低生產(chǎn)成本，生產(chǎn)出滿足社會(huì)需要的美白產(chǎn)品，并產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。光甘草定和MSH的最佳復(fù)配比例為0.01:1.0[10]，此次實(shí)驗(yàn)中美白劑照此配比進(jìn)行復(fù)配。

2.1.1 復(fù)配美白劑對(duì)促黑細(xì)胞激素（α-MSH）的抑制作用的測(cè)定

腦下垂體能分泌黑色素細(xì)胞刺激激素（α-MSH），它與Ⅰ型α-促黑色細(xì)胞激素受體（簡(jiǎn)稱MC1R）結(jié)合后，通過(guò)激活環(huán)單磷酸腺苷和蛋白活化酶A來(lái)激活酪氨酸酶，促進(jìn)黑色素的形成。有報(bào)道[3]指出，它還能促進(jìn)黑色素細(xì)胞的分裂增殖。本實(shí)驗(yàn)的機(jī)理是復(fù)合美白劑中的成分通過(guò)爭(zhēng)奪I型α-促黑色細(xì)胞激素受體，使得α-MSH失去受體而不能表達(dá)。

按照SEPPIC公司推薦的方法，從小鼠的黑素細(xì)胞B16/F1中提取MC1R，將MC1R放在有放射性配體（與MC1R受體有很高的親和性）的四個(gè)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，控制培養(yǎng)環(huán)境。然后分別將復(fù)配美白劑、曲酸、Vc棕櫚酸酯和熊果苷四種產(chǎn)品等量放入上述四個(gè)培養(yǎng)箱中觀察反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)部分產(chǎn)品能與MC1R受體結(jié)合并且替代了放射性配體與MC1R受體的結(jié)合位置。根據(jù)取代位多少計(jì)算產(chǎn)品對(duì)MC1R受體的爭(zhēng)奪率，結(jié)果見(jiàn)圖2。

從圖2可以看出，在爭(zhēng)奪α-MSH受體方面，與其他市場(chǎng)上常用美白劑相比，復(fù)配美白劑對(duì)促黑細(xì)胞激素有更好的抑制效果，爭(zhēng)奪率大于80%。

2.1.2 復(fù)配美白劑對(duì)酪氨酸酶的抑制作用的測(cè)定

黑色素的形成過(guò)程中酪氨酸酶是主要限速酶，在從酪氨酸向多巴轉(zhuǎn)化和多巴向多巴醌轉(zhuǎn)化過(guò)程中，都是由酪氨酸酶催化進(jìn)行的。酪氨酸酶直接控制著黑色素合成的起始及速度，決定了后續(xù)步驟是否能夠進(jìn)行下去。因此，阻止酪氨酸酶的合成是實(shí)現(xiàn)美白的關(guān)鍵步驟之一。實(shí)驗(yàn)按照姚莉等人[11]的方法測(cè)定了復(fù)配美白劑抑制酪氨酸酶的活性（結(jié)果見(jiàn)圖3）。

由圖3可以看出，美白劑在極低的濃度下也會(huì)有很好的抑制酪氨酸酶的效果，這為提高產(chǎn)品的安全性提供了很大的保障。

圖2 0.1%美白劑爭(zhēng)奪MC1R實(shí)驗(yàn)

2.1.3 復(fù)配美白劑對(duì)TRP-2的抑制作用

TRP-2是一種與酪氨酸酶有關(guān)的蛋白質(zhì)，其作用機(jī)理是促使所作用的底物發(fā)生重排，生成底物的某一同分異構(gòu)體，最終生成另一黑色素。即在多巴色素脫羧、重排生成5,6-二羥基吲哚（DHI）的同時(shí)，黑色素細(xì)胞內(nèi)部多巴色素由于多巴色素異構(gòu)酶的存在而發(fā)生重排，生成5,6-二羥基吲哚-2-羧酸（DHICA）。因此，該酶主要是調(diào)節(jié)DHICA的的生成速率，從而影響所生成黑色素分子的大小、結(jié)構(gòu)和種類。

實(shí)驗(yàn)采用液相色譜的方法（C18-ODS柱）測(cè)得復(fù)配美白劑在抑制TRP-2方面有很高的活性（表1）。抑制率＝1－有復(fù)配美白劑時(shí)的DHICA峰÷沒(méi)有復(fù)配美白劑時(shí)的DHICA峰。

由表1可以看出，在0.5×10-3mg/mL和0.5×10-10mg/mL兩種濃度下，復(fù)配美白劑對(duì)TRP-2的抑制率相同。因此，實(shí)驗(yàn)只需要少量美白劑便可達(dá)到高效抑制率，增加了產(chǎn)品的安全性。

2.1.4 復(fù)配美白劑對(duì)TRP-1的抑制作用

近年來(lái)對(duì)TRP-1（DHICA 氧化酶）功能的研究證明，該蛋白在黑色素合成的下游途徑中起重要作用。它能催化DHICA，最終合成DHICA黑色素，TRP-1主要通過(guò)氧化DHICA來(lái)最終合成黑色素[1]。按照Kawaguchi等人[5]的方法，使用等量復(fù)配美白劑進(jìn)行TRP-1抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4。

由圖4可以看出，三種美白劑中，復(fù)配美白劑的抑制效率最高。結(jié)果表明復(fù)，配美白劑在抗氧化性上有非常顯著的作用。

表1 復(fù)配美白劑對(duì)多巴互變酶的抑制

圖3 復(fù)配美白劑抑制酪氨酸酶活性曲線

圖4 復(fù)配美白劑對(duì)DHICA氧化酶的抑制作用

2.2 用細(xì)胞圖像分析法測(cè)試“三酶一素”抑制劑的美白效果

用電鏡觀察使用復(fù)配美白劑5天后對(duì)體外培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞的影響和對(duì)B16細(xì)胞形態(tài)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。

對(duì)比圖5中未使用復(fù)配美白劑的對(duì)照組和使用了復(fù)配美白劑的產(chǎn)品組，可以看出，使用復(fù)配美白劑5天后黑色素細(xì)胞明顯的減少，對(duì)皮膚的美白效果明顯。

由圖6可以看出，使用復(fù)配美白劑5天后黑色素瘤B16細(xì)胞的數(shù)目明顯減少，美白效果顯著。

圖5 美白劑對(duì)人皮膚色素細(xì)胞的影響

圖6 復(fù)配美白劑對(duì)B16細(xì)胞形態(tài)的影響

3 結(jié)論

“三酶一素”抑制劑應(yīng)用在美白護(hù)膚品中，對(duì)黑色素形成的各個(gè)階段所需要的酶進(jìn)行阻斷。從生物細(xì)胞水平和細(xì)胞圖像分析可知，復(fù)配的“三酶一素”抑制劑具有明顯的美白效果。美白劑用量較少，不僅可以提高產(chǎn)品的安全性和功效性，而且能夠極大地降低產(chǎn)品成本，增強(qiáng)企業(yè)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

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