歐陽和中 江蘇省丹陽市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 丹陽 212300

李云 山東省濟南市中心醫(yī)院急診科 濟南 250013

EPO對全腦缺血后低氧誘導(dǎo)因子1α及存活素表達的調(diào)節(jié)

歐陽和中 江蘇省丹陽市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 丹陽 212300

李云 山東省濟南市中心醫(yī)院急診科 濟南 250013

[目的]研究促紅細胞生成素對全腦缺血再灌注大鼠缺氧誘導(dǎo)因子1α和凋亡相關(guān)蛋白存活素的調(diào)節(jié)，探討其抗凋亡的可能機制。[方法]將成年雄性SD大鼠75只按隨機數(shù)字表法分為全腦缺血組(n=35)和全腦缺血EPO干預(yù)組(n=35),然后按再灌注時間不同又分為6h、12h、24h、48h、72h、5d和7d七個亞組。采用改良的Pu劉lsineli 4-VO法制作全腦缺血大鼠模型。應(yīng)用TUNEL染色檢測再灌注后不同時間點海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元凋亡水平，免疫組織化學(xué)方法檢測再灌注后不同時間點海馬CA1區(qū)缺氧誘導(dǎo)因子1α和存活素表達水平的變化。[結(jié)果]全腦缺血EPO干預(yù)組24h至7d亞組TUNEL陽性神經(jīng)元計數(shù)分別為1.50±0.73、3.14±0.88、5.78±1.03、7.78±1.79、10.34±1.82.與全腦缺血組相應(yīng)時間點亞組相比明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。全腦缺血EPO干預(yù)組48h至5d亞組HIF-1α表達陽性細胞計數(shù)分別為11.26±0.02、20.28±2.03、3.33±0.04,與全腦缺血組相應(yīng)時間點亞組相比明顯減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05).全腦缺血EPO干預(yù)組24h至5d亞組survivin蛋白表達陽性細胞計數(shù)分別為12.21±1.04、16.34±4.02、24.33±3.03、30.52±5.04,與全腦缺血組相應(yīng)時間點亞組相比明顯增高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。[結(jié)論]在全腦缺血急性期，EPO抑制HIF-1α的表達而使存活素表達升高，具有一定的神經(jīng)保護作用.

Global Cerebral Ischemia; hippocampus; Survivin;Erythropoietin; Hif-1α

促紅細胞生成素（EPO）基因是缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）的下游基因。EPO具有神經(jīng)保護作用，是近年來人們對這個神經(jīng)體液因子新的認(rèn)識，但其機制尚未明了。存活素(Survivin)是最近新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族成員。研究表明，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，多種細胞因子如EGF等可通過HIF-1α途徑上調(diào)survivin基因表達來阻止細胞凋亡。本實驗大鼠對全腦缺血大鼠應(yīng)用EPO，并檢測HIF-1α、Survivin在此干預(yù)措施下表達水平的變化以及該變化對缺血后神經(jīng)細胞凋亡的影響，通過研究這些變化之間的相關(guān)性，來探討全腦缺血后EPO抗凋亡神經(jīng)保護的可能機制。

1.材料和方法

1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠75只，體重315±20g，由山東大學(xué)實驗動物中心提供；促紅細胞生成素（商品名：益比奧）購于沈陽三生制藥股份有限公司；Survivin 多克隆抗體(鼠抗) 購于Santa Cruz公司HIF-1α多克隆抗體（兔抗）購于武漢博士德公司；細胞凋亡檢測試劑盒(In Situ Cell Apoptosis Detection Kit Ⅰ, POD)、多聚賴氨酸、DAB顯色試劑盒由武漢博士德公司提供。SP通用型試劑盒（sp-9000）（試劑盒組成包括：3%H2O2去離子水、封閉用正常山羊血清工作液、生物素化二抗工作液、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵蛋白素工作液）：購于北京中山金橋生物技術(shù)開發(fā)有限公司。powerlab多導(dǎo)電生理系統(tǒng)、Chart5分析軟件：ADInstruments，澳大利亞，由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程教研室提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將成年雄性SD大鼠75只按隨機數(shù)字表法分為全腦缺血組(n=35)和全腦缺血EPO干預(yù)組(n=35),然后按再灌注時間不同又分為6h、12h、24h、48h、72h、5d和7d7個亞組。

1.2.2 動物模型制作 采用改良的Pulsinelli[1]四血管阻斷法制作大鼠全腦缺血再灌注模型。大鼠術(shù)前24h禁食，自由飲水。經(jīng)10%的水合氯醛（300～350mL/kg）麻醉后,俯臥位固定,于頸后正中切長約2cm的切口,顯露第1頸椎雙側(cè)的翼孔,插入雙極電凝針,電凝雙側(cè)椎動脈使之完全閉合,縫合傷口,置籠喂養(yǎng),自由飲食。24h后同法麻醉,仰臥位固定,頸前正中線切長約2cm切口,暴露雙側(cè)頸總動脈, 于頭皮下插入針狀電極,動態(tài)監(jiān)測腦電變化，然后用微型無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈,以出現(xiàn)靜息腦電波為判定大鼠全腦缺血的標(biāo)準(zhǔn)，10min后放開動脈夾,恢復(fù)血液供應(yīng),縫合傷口。假手術(shù)組動物僅灼燒雙側(cè)椎動脈,但不夾閉雙側(cè)頸總動脈,其余步驟同上。

1.2.3 給藥方法 GI+EPO組中，全腦缺血10分鐘取下動脈夾后，立即給予EPO腹腔注射（4000U/kg/day），其中6h、12h和1d亞組只在缺血后給予一次EPO治療，2d亞組第二天再給予一次同樣劑量的EPO治療，3d、5d和7d亞組第二天和第三天分別再給予一次同樣劑量的EPO治療。全腦缺血組每天給予等劑量生理鹽水腹腔注射。假手術(shù)組不給予干預(yù)措施。

1.2.4 標(biāo)本獲取 將大鼠在相應(yīng)的時間點用10%水合氯醛麻醉后，沿正中線剪開胸腔，將連接著灌注管的粗針頭從心尖部插入左心室，再入升主動脈，用大止血鉗固定針頭，先用4℃肝素化0.1M的PBS溶液200ml迅速沖凈腦內(nèi)血液，再用4℃0.1M的PBS-4%多聚甲醛溶液400ml灌注固定30分鐘，大剪刀斷頭，放于冰盒上，迅速分離腦組織（注意保持腦組織完整性）置于0.1M的PBS -4%多聚甲醛溶液中后固定24小時，然后放入30%蔗糖溶液中脫水直至腦組織沉至瓶底。 冰凍切片機（-20℃）自視交叉后2.2mm處向后連續(xù)冠狀切片,染色。

1.2.5 TUNEL染色標(biāo)記凋亡細胞 用計算機圖像儀軟件Image Pro Plus處理TUNEL染色片，計算海馬CA1區(qū)TUNEL陽性神經(jīng)細胞（核）數(shù)。

1.2.6 免疫組織化學(xué)（SP法）檢測海馬CA1區(qū)HIF-1、survivin陽性細胞計數(shù) 用SP法進行CA1區(qū)HIF-1α、survivin免疫組化，切片在400倍視野下進行海馬CA1區(qū)CA1區(qū)HIF-1α與survivin陽性細胞計數(shù)。每張切片海馬CA1 區(qū)任選5個視野,對CA1區(qū)HIF-1 α與survivin陽性細胞計數(shù),計算出該切片的平均CA1區(qū)HIF-1α與survivin陽性細胞數(shù)。

2.結(jié) 果

（一）、TUNEL染色

GI組再灌注后24小時后TUNEL陽性細胞明顯增加，24小時、48小時、72小時、5天、7天亞組與Sham組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）；

GI+EPO組再灌注48小時后，TUNEL陽性細胞才有明顯增加。48小時、72小時、5天、7天亞組細胞數(shù)與Sham組相比有顯著差異（p<0.05）。

配對t檢驗

在相應(yīng)的24小時、48小時、72小時、5天、7天的時間點亞組，GI+EPO組的TUNEL細胞數(shù)目比GI組的明顯少，具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）（表1）。

表1 各組大鼠海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細胞數(shù)( x±s, 個) (40×10)P=0.0001

（二）、缺氧誘導(dǎo)因子1α的表達（表2）

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)HIF－1α陽性細胞數(shù)(個, x±s)Tab2 Expression of HIF－1α protein(number of positive cells) in the CA1 area of hippocampus from sham group、GI group and GI+EPO group

GI組再灌注12 h后在海馬CA1區(qū)中可見HIF-1α表達增加, 3 d 達高峰,后逐漸下降；與Sham組比較GI組24 h、3 d、5 d、7 d亞組的HIF-1α的表達均明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義( P<0.05)（圖1）。

圖1.缺血再灌注3d HIF-1α表達達高峰（×400）Fig.1 the expression of HIF-1α peaked at 72h in ischemia/reperfusion group（×400）

GI+EPO組再灌注后12h也可見HIF-1α的表達開始增加, 也在 3 d時達高峰，5 d、7 d明顯下降。與GI組相比, 24 h、2 d、3 d、5 d 亞組HIF-1α的表達顯著降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義( P<0.05)，12 h亞組HIF-1α的表達水平稍低于GI組，計算無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖2）。

圖2 治療組3d亞組HIF-1α表達明顯低于缺血再灌注（×400）Fig.2 the expression of HIF-1α was obviously lower in 3d subgroups of treatment group than that in model group（×400）

存活素的表達（表3）

表3 免疫組織化學(xué)染色顯示各組大鼠海馬CA1區(qū)Survivin表達陽性細胞數(shù)(個, x±s)Tab3:Expression of Survivin protein(number of positive cells) in the CA1 area of hippocampus from sham group、GI group and GI+EPO group

在假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)中極少見陽性表達。

GI組在再灌注6h～48h極少見到陽性表達，72h后在海馬CA1區(qū)中可見Survivin少量表達, 7 d 達高峰, 與Sham組比較GI組72 h、5 d、7 d亞組的Survivin的表達均明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) ;

圖3 缺血再灌注7d survivin表達達高峰（×400）Fig.3 the expression of survivin peaked at 7d in ischemia/reperfusion group（×400）

GI+EPO組再灌注后6 h、12 h極少見到陽性表達，24h即見Survivin的高表達,之后隨時間延長,其表達明顯增加,5d 時達高峰，7d時稍下降。與GI組相比, 再灌注后24 h、48 h、72 h、5 d 時Survivin的表達顯著升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義( P<0.05)，且表達時間及高峰提前。7d亞組survivin表達水平稍高于GI組，計算無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖4 缺血再灌注5d survivin表達達高峰（×400）Fig.4 the expression of survivin peaked at 5d in ischemia/reperfusion group（×400）

3.討 論

全腦缺血缺氧常發(fā)生在臨床常見的各種休克、心臟驟停、哮喘持續(xù)狀態(tài)、CO中毒等之中，由于腦細胞的能量供應(yīng)主要來源于糖有氧代謝，幾乎沒有能量儲備，因此腦組織對缺血缺氧十分敏感，尤其是大腦皮質(zhì)（第3、4層）和海馬神經(jīng)元。新近有實驗研究表明，大鼠全腦缺血12分鐘再灌注3天時，海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元有92%發(fā)生凋亡[2]。

細胞凋亡[3]由基因表達調(diào)控，其過程紛繁復(fù)雜。目前已發(fā)現(xiàn)了眾多促凋亡基因如p53、p21、caspase、bcl-2等；同時也相應(yīng)存在一些抗凋亡基因[4]，如促紅細胞生成基因、EPO編碼基因、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及血管內(nèi)皮生長因子受體-1(VEGFR-1,Flt-1)的編碼基因等。而以上基因均由缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）調(diào)控表達。研究表明，嚴(yán)重腦缺血缺氧后HIF-1的活化形式HIF-1α的過量表達的促神經(jīng)細胞凋亡作用遠大于其神經(jīng)保護作用。

Survivin作為IAP家族成員之一，能夠通過促進組織微血管生成[5、6、7]、抑制天冬氨酸特異性的半胱氨酸酶(cysteine proteinases with specificity for aspartic acid residues, caspase)的表達[8、9、10]而發(fā)揮強大的抗凋亡作用。如何降低缺血性腦血管病腦組織中Hif-1α及其下游促凋亡基因的過度表達、提高survivin等抗凋亡因子的表達而起到腦保護作用，是目前研究的熱點之一，如日本學(xué)者Okazaki等嘗試了給予大腦中動脈梗死的小鼠模型注射骨髓基質(zhì)細胞來提高survivin的表達，結(jié)果顯示有一定效果[11]。而有研究發(fā)現(xiàn)，全腦缺血后應(yīng)用EPO干預(yù)處理可降低HIF-1的下游促凋亡基因rtp-801等的表達。

HIF-1α與survivin在缺血缺氧環(huán)境下的表達具有相關(guān)性，目前在惡性腫瘤的研究中已得到大量的驗證。Hongzhen Zhang等在對人食道鱗狀上皮細胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)HIF-1α與survivin協(xié)同表達，在腫瘤的惡性程度、臨床分期及遠端轉(zhuǎn)移等起到重要作用[12]。

Edward M.Conway[13]等研究觀察到缺氧相關(guān)的存活素mRNA表達水平的增加在HIF-1α基因敲除的胚胎干細胞低氧培養(yǎng)中更加顯著。這個結(jié)果通過對幾組相同環(huán)境下的ES細胞克隆進行實驗而確認(rèn)，提示HIF-1α在缺氧條件下可能直接也可能間接地抑制了存活素的表達。

因此本研究應(yīng)用EPO治療干預(yù)全腦缺血模型，檢測HIF-1α與survivin表達的變化，表明應(yīng)用EPO可顯著延遲并較少全腦缺氧再灌注后海馬神經(jīng)元的凋亡；與之相對應(yīng)的，應(yīng)用EPO后，24 h、2 d、3d、5 d 亞組HIF-1α的表達顯著降低，而24h、48h、72h、5 d時Survivin的表達顯著升高，表明HIF-1α與Survivin的表達具有相關(guān)性，并能夠被EPO所調(diào)控。

由此推論，EPO可能通過反饋抑制嚴(yán)重腦缺氧后HIF-1α的過度表達而解除了對survivin表達的抑制來發(fā)揮抗凋亡作用。

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EFFECT OF ERYTHROPOIETIN ON HIF-1α、SURVIVIN FOLLOWING GLOBAL CEREBRAL ISCHEMIA IN RATS

Ouyang He Zhong(Department of neurology,Danyang people’s Hospital of Jiangsu province,Danyang 212300 ,Jiangsu,China)

Objective

To observe the effects of EPO on the Hif-1α、survivin expression after global cerebral ischemiareperfusion in rats,exploring its antiapoptosis mechanisms.

Methods

The experimental GI model was established by 4-vessel occlusion method and confirmed successfully by an electroencephalogram (EEG).Seventy-nine adult male Sprague–Dawley rats were randomly divided into sham group (n=5), global cerebral ischemia group(GI, n=35) and global cerebral ischemia + EPO treatment group (GI+EPO, n=35)，and the two latter groups to seven subsets each with 5 rats.

EPO were administered to rats in GI+EPO group by abdominal cavity injection (4000u/ kg /day)one time a day with the same dosage in the first 3 days.

The cerebral hippocampus tissues were obtained 3 days after sham operation in sham group and 6、12 hours、1、2、3、5 and 7 days after reperfusion in the GI and GI +EPO groups for determining apoptosis of cells by TUNEL and the expressions of Hif-1α、survivin proteins by Immunohistochemistry staining method.

All the data in this study were expressed as mean±standard deviation (SD).A value of P<0.05 was considered statistically significant.

Results

TUNEL staining

Compared to the sham group, the number of apoptotic cells in subset 1、2、3、5、7d of GI group and subset 2、3、5、7d of GI+EPO group were significantly increased.

The number of apoptotic cells in subset 1、2、3、5、7d of GI+EPO group were significantly less than of GI group.

Immunohistochemistry staining

Expression of Hif-1α

Compared to the sham group Hif-1αimmunopositive cells were significantly increased in the injured hippocampus in 1、2、3、5、7 d subsets of GI group(P<0.01) and GI+EPO group.

Compared to the corresponding subsets of GI group，expression level of survivin in subsets 1、2、3、5d of GI+EPO were significantly higher.Expression of survivin

Compared to the sham group survivin immunopositive cells were significantly increased in the injured hippocampus in 3、5、7 d subsets of GI group(P<0.01) and in 1、2、3、5、7d subsets of GI+EPO group.

Compared to the corresponding subsets of GI group，expression level of survivin in subsets 1、2、3、5d of GI+EPO were significantly higher.EPO significantly decreased the expression of Hif-1αand increased the expression of survivin(P<0.05), and decreased significantly the number of apoptotic cells compared to GI group(P<0.05).Conclusion

Rivalry to the overexpression of Hif-1αby EPO can induce overexpression of survivin, which might be one of the mechanisms in inhibiting neuronal apoptosis by EPO in the hippocampus after GBI.

10.3969/j.issn.1001-8972.2011.04.075

全腦缺血再灌注 ；海馬；存活素；促紅細胞生成素；缺氧誘導(dǎo)因子－1α