郭艾英，凌 云，張志雯

(1河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院，河北秦皇島，066600;2中糧華夏長城葡萄酒有限公司)

蛋白酶是一類可催化蛋白質(zhì)水解反應(yīng)的酶，是重要的工業(yè)用酶之一，已被廣泛應(yīng)用于食品、洗滌、皮革、飼料等工業(yè)。目前國內(nèi)蛋白酶在常溫和低溫下酶活力不高，不能滿足市場需求，大規(guī)模用酶主要依賴進口［1］。海洋微生物自身生長環(huán)境(高壓、高鹽、低溫、低營養(yǎng)、低光照等)決定其分泌的胞外酶具有在低溫和高鹽存在下能夠繼續(xù)保持較高的活力，并且經(jīng)過溫和的熱處理即可使低溫酶活力喪失或低溫菌株選擇性失活，而不會影響產(chǎn)品的品質(zhì)，這使得該酶也能夠應(yīng)用于某些條件苛刻的生產(chǎn)工藝中［2～4］。對海洋微生物低溫酶的研究與開發(fā)，已在國內(nèi)外引起了廣泛關(guān)注。由海洋微生物生產(chǎn)低溫酶已成為發(fā)達國家開發(fā)新型酶制劑的重要途徑［5～7］，國內(nèi)已經(jīng)從黃海海水、北極沉積物或海水中分離到多株產(chǎn)低溫蛋白酶的菌株［1，8～10］，其菌種、酶的性質(zhì)也不盡相同。作者首次從渤海海域采集的樣品分離獲得一株產(chǎn)蛋白酶活力較高的菌株HYM－16，初步鑒定為黃色桿菌屬，該菌株所產(chǎn)的蛋白酶在4℃條件下處理48 h，酶活保持不變，屬低溫酶，筆者對其生長條件進行分析，以期為工業(yè)應(yīng)用和后續(xù)研究奠定理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 樣品采集

2009年10月上旬于渤海秦皇島海域東經(jīng)119°60′，北緯39°93′附近，采集海水樣品共20份。

1．2 培養(yǎng)基

1．2．1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂20 g/L，作為菌體初篩和斜面菌種保藏用。

1．2．2 篩選培養(yǎng)基 葡萄糖 0．5 g/L，KH2PO40．5 g/L，K2HPO40．5 g/L，酪蛋白 10 g/L，瓊脂 20 g/L，用于篩選蛋白酶產(chǎn)生菌。

1．2．3 種子培養(yǎng)基 葡萄糖5 g/L，蛋白胨10 g/L。

1．2．4 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖0．5 g/L，K2HPO40．5 g/L，KH2PO40．5 g/L，蛋白胨 10 g/L。以上培養(yǎng)基pH 7．2～7．4，均用陳海水代替蒸餾水配制，121℃滅菌30 min。

1．3 菌株篩選

1．3．1 菌株初篩 將采集到的樣品經(jīng)肉湯培養(yǎng)基富集培養(yǎng)24 h，用滅菌陳海水進行梯度稀釋后涂布營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待形成單菌落，再點種于篩選平板進行初篩。培養(yǎng)48 h后，在菌落周圍滴加10 g/L三氯乙酸，以鋪滿平板為度。選取水解圈較大的菌株，平板劃線純化，斜面保藏，備用。

1．3．2 菌株復(fù)篩 將初篩菌株接種于裝液量50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，180 r/min，25℃震蕩培養(yǎng)48 h，收集發(fā)酵液進行酶活力測定。

1．4 酶活力測定

將發(fā)酵液在4 500 r/min，4℃離心10 min，取上清液作為粗酶液，采用Folin－酚法測定蛋白酶活力［11］。以1 mL酶液在一定條件下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量定義為1個酶活單位(U)。

1．5 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1．5．1 培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)酶的影響 挑1環(huán)菌株接入種子培養(yǎng)基，180 r/min，震蕩培養(yǎng)12 h，以體積分數(shù)為 0．01 的菌液轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，180 r/min，25 ℃震蕩培養(yǎng)，分別培養(yǎng) 12，24，36，48，60，72 h，測定發(fā)酵液中蛋白酶活力。

1．5．2 接種量對產(chǎn)酶的影響 將震蕩培養(yǎng)12 h的種子液，分別以體積分數(shù)為0．005，0．010，0．015和0．020的菌液轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，180 r/min，25℃的條件下震蕩培養(yǎng)，48 h后測定發(fā)酵液中蛋白酶活力。

1．5．3 搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響 將震蕩培養(yǎng)12 h的種子液，以體積分數(shù)為0．01的菌液轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，控制搖床轉(zhuǎn)速分別為120，140，160，180，200，220 r/min，25 ℃的條件下震蕩培養(yǎng)，48 h 后測定發(fā)酵液中蛋白酶活力。

1．5．4 不同碳源、氮源對產(chǎn)酶的影響 在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入相同質(zhì)量濃度(0．5 g/L)的4種碳源(麥芽糖、蔗糖、乙酸鉀、淀粉)和4種氮源(硝酸鉀、酵母粉、豆餅粉、硫酸銨)，研究其對產(chǎn)酶的影響。將震蕩培養(yǎng)12 h的種子液，以體積分數(shù)為0．01的接種量，培養(yǎng)48 h后測定發(fā)酵液中蛋白酶活力。

1．5．5 不同金屬離子對產(chǎn)酶的影響 在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為0．1 g/L的4種不同金屬離子(Mg2+，Mn2+，F(xiàn)e2+，Ca2+)，將震蕩培養(yǎng)12 h的種子液，以體積分數(shù)0．01接種量，培養(yǎng)48 h后測定發(fā)酵液中蛋白酶活力。

1．5．6 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗 選擇影響酶活的碳源、氮源和金屬離子為考慮因素，選用L9(34)正交設(shè)計(表1)，以酶活力為指標，優(yōu)化培養(yǎng)基的組成成分。

2 結(jié)果與分析

2．1 菌株的分離

將取得的水樣20份，經(jīng)富集培養(yǎng)，稀釋涂布，培養(yǎng)18～24 h后得到148個單菌落，挑取單菌落于篩選平板上培養(yǎng)，37株分泌蛋白酶。挑選其中D/d大于3的13株經(jīng)搖瓶復(fù)篩，依據(jù)Folin－酚法測定蛋白酶活，確定HYM－16號菌株，酶活達410．1×103U·L－1，是一株性能良好的出發(fā)菌株。國內(nèi)報道的出發(fā)菌株的活力在100×103U·L－1上下［10］。該菌株在篩選平板上培養(yǎng)48 h時所形成的水解圈如圖1所示。

表1 正交試驗因素水平表 g·L－1

圖1 HYM－16菌株在篩選平板培養(yǎng)48 h產(chǎn)生的水解圈

2．2 菌種的初步鑒定

篩選的HYM－16菌株為長桿狀，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈圓形同心環(huán)，臍狀，邊緣整齊，表面閃光，油脂狀，淺黃色。生理生化反應(yīng)為革蘭氏染色陰性，接觸酶陽性，好氧，能在甲醇、乙醇、丙醇丁醇和有機酸為唯一碳源時異養(yǎng)生活。根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［12］相關(guān)內(nèi)容，初步鑒定為黃色桿菌屬(Xanthobacter sp．)。

2．3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2．3．1 培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響 在不同培養(yǎng)時間處理下，測定酶活力，該菌株在12 h開始產(chǎn)酶，24 h后大量產(chǎn)酶，至48 h時，酶產(chǎn)量達到高峰，酶活為416．6×103U·L－1，繼續(xù)培養(yǎng)，酶活力顯著下降(圖2)。其原因可能是在發(fā)酵前期菌體經(jīng)過短暫的適應(yīng)期即進入對數(shù)生長期，外部環(huán)境有利于菌體的生長和代謝產(chǎn)物的合成，在48 h產(chǎn)酶量達到最大;到發(fā)酵后期，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)減少，產(chǎn)物量及有害代謝物的增多抑制菌體的生長和產(chǎn)物的合成，造成酶活力的下降，因此選擇48 h為最佳培養(yǎng)時間。

2．3．2 不同接種量對產(chǎn)酶的影響 在三角瓶裝液量相同的條件下，測試了不同接種量對產(chǎn)酶的影響(圖3)。結(jié)果表明，接種量的大小對產(chǎn)酶影響較大，接種量較低和較高都會抑制酶活，體積分數(shù)0．01時蛋白酶活力最大。小于0．01時，隨接種量的增加其產(chǎn)酶活力也增大，再增加接種量，酶活反而降低。這可能是接種量較小時，菌體產(chǎn)生的胞外酶較少，影響菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的利用，抑制產(chǎn)酶，而接種量較大時，菌體生長過快，發(fā)酵液黏度增加，造成溶氧不足，影響產(chǎn)物的合成。

圖2 不同培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響

圖3 不同接種量對產(chǎn)酶的影響

2．3．3 不同搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響 在其它條件相同的情況下控制不同的搖床轉(zhuǎn)速，測定發(fā)酵液中蛋白酶活力(圖4)。結(jié)果表明，隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加，產(chǎn)酶量增多，180 r/min時產(chǎn)酶量最大，為411．3×103U·L－1，再增大轉(zhuǎn)速，產(chǎn)酶量有所下降。說明搖床轉(zhuǎn)速影響培養(yǎng)液的溶氧量，適當?shù)娜苎跛接欣谠摼甑纳L和代謝產(chǎn)物的合成，但溶氧太高反而抑制蛋白酶的形成。

2．3．4 不同碳源、氮源對產(chǎn)酶的影響 在產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中試驗了相同濃度的4種碳源和氮源，培養(yǎng)后測定蛋白酶活力(圖5)。結(jié)果表明，碳源中蔗糖效果最好，產(chǎn)酶量最高，酶活為506．4×103U·L－1，其次為葡萄糖和淀粉。蔗糖優(yōu)于葡萄糖的原因可能是菌體以蔗糖作為碳源可解除葡萄糖效應(yīng)，與國外報道的葡萄糖抑制蛋白酶的生成相似［13］;淀粉作為一種廉價的碳源也具有較高的產(chǎn)酶水平，可能是其中含有復(fù)雜蛋白成分具有誘導(dǎo)作用。

菌株利用有機氮源產(chǎn)酶能力均高于無機氮源，其中豆餅粉效果最好，達468．0×103U·L－1(圖6)，酵母浸出物和蛋白胨次之。其原因可能是無機氮源成分較單一，影響產(chǎn)酶量;(NH4)2SO4為生理酸性物質(zhì)，影響產(chǎn)酶環(huán)境的pH，抑制蛋白酶的分泌，因而產(chǎn)量最低，此研究結(jié)果與Sinha報道的硫酸銨對產(chǎn)酶的促進作用存在分歧［14］;而有機氮源中可能含有的無機鹽、較豐富的B族維生素及生長因子促進了蛋白酶的產(chǎn)生，與Sen和Gajju等的研究結(jié)果一致［13，15］。因此確定豆餅粉為后續(xù)試驗氮源。

圖4 搖床不同轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響

圖5 不同碳源對產(chǎn)酶的影響

2．3．5 金屬離子對產(chǎn)酶的影響 在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別以適宜濃度添加4種金屬離子考察對蛋白酶活的影響(圖7)，結(jié)果表明，較低金屬離子濃度下，與對照相比，Mg2+和Ca2+對該菌產(chǎn)酶具有促進作用，F(xiàn)e2+和Mn2+則對蛋白酶抑制作用明顯，其中Fe2+作用更強，酶活僅是對照的10．99%。這可能是由于Ca2+和Mg2+穩(wěn)定酶結(jié)構(gòu)的同時，也起到了激活酶的作用;而Mn2+及Fe2+可能與酶中心的活性基團結(jié)合形成化合物，導(dǎo)致蛋白酶活力下降。

圖6 不同氮源對產(chǎn)酶的影響

圖7 不同金屬離子對產(chǎn)酶量的影響

2．3．6 碳源、氮源和金屬離子合適濃度對產(chǎn)酶的影響 產(chǎn)酶最適培養(yǎng)基優(yōu)化試驗結(jié)果如表2表3所示，由表2各列的極差R值和表3中F值可得，各因素影響主次順序為B＞A＞D＞C，即在實驗設(shè)定的因素中，氮源中豆餅粉和碳源蔗糖的添加量對菌株產(chǎn)酶影響顯著，而Mg2+的添加量對產(chǎn)酶影響不大，Sun－og等研究結(jié)果表明，高濃度的Mg2+有助于提高蛋白酶活力［16］。由2．3．5可知Mg2+的添加能夠促進產(chǎn)酶，但其添加量對產(chǎn)酶影響較小，其原因有待進一步考察。在優(yōu)化培養(yǎng)基因素水平上，對因素A和B，最大數(shù)均是K2，因此選擇A2B2，對于因素C和D選擇最大數(shù)C2D1，因此最佳組合為:A2B2C2D1，綜合基礎(chǔ)培養(yǎng)基得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖 1 g/L，豆餅粉 20 g/L，MgCl20．4 g/L，K2HPO40．5 g/L，KH2PO40．5 g/L。

表2 正交試驗L9(34)結(jié)果及極差分析

表3 方差分析結(jié)果

表4 培養(yǎng)基優(yōu)化后的蛋白酶活力及相對產(chǎn)率變化

2．4 優(yōu)化培養(yǎng)條件的驗證試驗

為了進一步驗證正交試驗優(yōu)選出的最佳組合方案A2B2C2D1，將活化菌株接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，以體積分數(shù)0．01的接種量分別轉(zhuǎn)接最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，測定酶活(表4)?？芍獌?yōu)化后的培養(yǎng)基酶活較基礎(chǔ)培養(yǎng)基增加了46．9%，3次試驗具有重現(xiàn)性，結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

(1)采用梯度稀釋法從渤海海域分離得到148株單菌落，其中37株具有分泌蛋白酶的能力，經(jīng)過平板初篩和搖瓶復(fù)篩確定酶活410．1×103U·L－1的HYM－16為研究的出發(fā)菌株，初步鑒定為黃色桿菌屬(Xanthobacter sp．)。

(2)研究了發(fā)酵條件、培養(yǎng)基成份對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。以酶活力為依據(jù)，得出在裝液量為50 mL的250 mL的三角瓶中，以體積分數(shù)為0．01的接種量，180 r/min進行發(fā)酵培養(yǎng)，48 h時達到最高產(chǎn)酶水平;最佳的碳源、氮源分別是蔗糖和豆餅粉，Mg2+能夠促進產(chǎn)酶。

(3)優(yōu)化培養(yǎng)條件得出各因素影響主次順序:豆餅粉＞蔗糖＞K2HP04＞MgCl2;最佳發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖 1 g/L，豆餅粉 20 g/L，MgCl20．4 g/L，K2HPO40．5 g/L，KH2PO40．5 g/L。優(yōu)化后的培養(yǎng)基較基礎(chǔ)培養(yǎng)基酶活提高46．9%。該蛋白酶的穩(wěn)定性較好，粗酶液在4℃條件下處理48 h后酶活不變，具有進一步開發(fā)利用的潛力。

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