王玉江，韓增華

（黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江哈爾濱150010）

黑木耳（Auricularia auricula）是我國廣泛人工栽培的食用菌品種，黑龍江省栽培量大，約占總產(chǎn)量的60%[1]。黑木耳為腐生異養(yǎng)真菌，需吸收培養(yǎng)基質(zhì)中的碳、氮營養(yǎng)來完成自身生長。黑木耳在培養(yǎng)的過程中會不斷的吸收、分解培養(yǎng)料中的營養(yǎng)，以滿足不同階段的菌株生長[2]。本研究通過對菌絲生長階段、后熟階段和出耳芽階段基質(zhì)中的還原糖、多糖、總糖和可溶性蛋白含量變化的測定，找出各階段各指標(biāo)的變化情況，分析其在菌絲生長發(fā)育階段和出耳前期的變化趨勢，研究黑木耳生長不同時期的代謝調(diào)控和出耳芽機制，為黑木耳栽培管理提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

黑29（黑龍江省科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心提供）。

1.1.2 培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基：土豆200g（煮汁1000 mL），瓊脂粉14.0g，葡萄糖 20.0g，磷酸二氫鉀 3.0g，硫酸鎂 1.5g，蛋白胨0.5g，維生素B110.0mg，pH自然。原種、栽培種培養(yǎng)基：木屑79%，麩皮20%，石膏1%，含水量為65%，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 菌種制作

原種和不同栽培種培養(yǎng)料分別裝500mL葡萄糖玻璃瓶和15×31cm聚乙烯折角袋，原種每瓶裝入培養(yǎng)料合干料約175g（濕重500g），栽培種每袋裝入培養(yǎng)料合干料280g（濕重800g），121℃下滅菌90min，取1.5cm2的在母種培養(yǎng)基上活化菌種接種于原種培養(yǎng)料，25℃培養(yǎng)至菌絲發(fā)滿。以1/50的接種量接入栽培種培養(yǎng)料中，25℃培養(yǎng)，40d長滿袋，25℃繼續(xù)培養(yǎng)至80d后熟，開12個1.5 cm×1.5cm“V”型口。

1.2.2 催耳芽管理

恒溫恒濕培養(yǎng)箱催芽溫度15～25℃，相對濕度85%～95%，光照 65～80Lx，CO2濃度 410～614 ppm。

1.2.3 取樣時期

分別于菌種接種后的 20d、30d、40d、50d、60d、70d、80d、82d（割口第二天）、92d（耳線形成）、102d（現(xiàn)耳芽期取樣）。

1.2.4 樣品處理

將長滿菌絲的樣品打碎，混勻，放于105℃烘箱內(nèi)烘干，小型粉碎機粉碎，過120目篩，繼續(xù)烘干至恒重，為待測樣品。

1.2.5 還原糖的測定[3]

準(zhǔn)確稱取0.5g不同培養(yǎng)時期的樣品于試管中，加入15mL蒸餾水，50℃下恒溫浸提20min，離心過濾，取全部濾液在25ml容量瓶中定容，3個重復(fù)。每個重復(fù)取l.0mL濾液，各加入2.0mL DNS，于沸水浴中加熱2min進(jìn)行顯色，取出后用流動水迅速冷卻，各加入9.0mL蒸餾水，搖勻，540nm處測定光吸收值，從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出葡萄糖質(zhì)量，計算樣品中還原糖含量。

1.2.6 總糖的測定[3]

準(zhǔn)確稱取0.2g樣品于試管中，加6.0mol/L的鹽酸4.0mL和蒸餾水6.0mL，于沸水中煮30min，冷卻后加1滴酚酞，6.0mol/L氫氧化鈉中和至呈微紅色，離心過濾后，在25mL容量瓶中定容，以下步驟同還原糖測定。

1.2.7 粗多糖含量測定[4]

1.2.7.1 樣品提取 準(zhǔn)確稱取樣品2.0g，置于100mL容量瓶中，加水80mL左右，于沸水浴上加熱2h，冷卻至室溫后補加水至刻度，混勻，過濾。取樣品濾液4.0mL置于50mL離心管中，加入無水乙醇16mL，混勻后，以4000r/min離心15min，棄去上清液,沉淀用乙醇溶液5.0mL洗滌，離心后棄去上清液，反復(fù)3～4次操作,自然晾干，加水2.0mL溶解多糖，為樣品測定液。

1.2.7.2 測定 取樣品測定液1.0mL置于25mL試管中，加入苯酚溶液1.0mL，混勻后，小心加入濃硫酸5.0mL，置于水浴中煮沸10min，冷卻至室溫,1cm比色皿490nm處分光光度計測定吸光度值，以水替代樣品做空白對照，3個重復(fù)。從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出葡萄糖質(zhì)量，計算樣品中粗多糖含量。

l.2.8 可溶性蛋白質(zhì)含量測定

準(zhǔn)確稱量樣品0.lg，放研缽內(nèi)加pH7.5磷酸鹽緩沖液2.0mL研磨至糊狀，再加入5.0mL緩沖液浸提30min，5000r/min離心，將上清液取出定容至25mL。取定容提取液1.0 mL于試管中，加入考馬斯亮藍(lán)5.0mL搖勻，分光光度計595nm下測定OD值，根據(jù)所測定的OD值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算提取液的蛋白質(zhì)濃度和樣品的蛋白質(zhì)含量，實驗設(shè)3個重復(fù)。

2 結(jié) 果

2.1 不同生長期基質(zhì)中還原糖含量變化

從圖1看出：還原糖含量在菌絲生長期、菌絲后熟期、開孔期一直呈下降趨勢，培養(yǎng)20d（菌絲峰頂至生長至1/5高度）還原糖含量最高，達(dá)5.72mg/g干物質(zhì)，在菌絲生長20d后至后熟期還原糖含量逐漸下降，至開口時基質(zhì)中還原糖降至0.22 mg/g干物質(zhì)，之后還原糖開始急劇增加，且增加幅度較快。

圖1 不同生長期培養(yǎng)基質(zhì)中還原糖含量Fig.1 Reducing sugar content in different growth culture media

2.2 不同生長期基質(zhì)中總糖含量變化

總糖含量變化見圖2。

圖2 不同生長期培養(yǎng)基質(zhì)中總糖含量Fig.2 Total sugar content in different growth culture media

在不同生長期內(nèi)總糖含量變化相對較小，含量較高的時期為培養(yǎng)的20d，含量為289.4 mg/g干物質(zhì)，含量較低的時期為開孔第2d，含量為183.6 mg/g干物質(zhì)。菌絲生長期內(nèi)（40d內(nèi)）含量逐漸下降，后熟前期（40～60d）總糖含量有小幅增加，后熟后期（60～80d）至開孔期稍有下降，并維持一定水平，開孔后至出耳線多糖含量再次升高，至出耳芽時又有所下降。后熟期、催耳芽期總糖含量變化幅度不大，呈小幅度升高、下降，并一直維持相對較高的含量水平。

2.3 不同生長期基質(zhì)中多糖含量變化

多糖含量變化見圖3，在整個生長期及催耳期多糖含量變化幅度較大。菌絲培養(yǎng)前期（前30d），培養(yǎng)基質(zhì)中的多糖含量迅速下降，之后有所回升，此時是黑木耳菌絲旺盛生長期。后熟期（40～80d）多糖含量迅速降至較低水平，至開孔后多糖含量迅速升高，至出耳線期升至較高水平，之后再次下降。

圖3 不同生長期培養(yǎng)基質(zhì)中多糖含量Fig.3 Polysaccharide content in different growth culture media

2.4 不同生長期基質(zhì)中可溶性蛋白質(zhì)含量變化

可溶性蛋白質(zhì)在菌絲生長期及后熟期含量相對較低（圖4），在耳線形成期達(dá)到最高，含量為2.73 mg/g干物質(zhì)。菌絲生長的前30d，呈下降趨勢，至40d有所升高，之后在后熟期內(nèi)維持較低的水平，開孔后，基質(zhì)中的可溶性蛋白質(zhì)升高幅度較快，至出耳芽時稍有下降。

圖4 不同生長期培養(yǎng)基質(zhì)中可溶性蛋白含量Fig.4 Soluble protein content in different growth culture media

3 討 論

不同時期基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)變化表明，菌絲在不同時期生長消耗和代謝的營養(yǎng)物質(zhì)有差異[5]。菌絲前期旺盛生長時，會迅速消耗基質(zhì)中的營養(yǎng)物質(zhì)，同時菌絲中積累的營養(yǎng)物質(zhì)還不夠充分，此時表現(xiàn)為各營養(yǎng)物質(zhì)的消耗下降[6]。其中多糖、還原糖在菌絲生長期和后熟期一直呈下降趨勢，表現(xiàn)為營養(yǎng)生長期的生長消耗，而在開孔后這兩種物質(zhì)在培養(yǎng)基中的積累量迅速增加，直至出耳芽時再次下降。可溶性蛋白質(zhì)和總糖的變化趨勢大致相同，菌絲生長初期含量有所下降，至積溫期有小幅的升高并維持一定的含量，開口后兩種營養(yǎng)物質(zhì)在基質(zhì)中又迅速積累至較高濃度，出耳期各營養(yǎng)物質(zhì)再次下降。由上述變化分析可知，黑木耳菌絲生長期及后熟期菌絲生長需消耗培養(yǎng)基質(zhì)中的營養(yǎng)物質(zhì)，同時菌絲生長會積累一定的營養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)含量表現(xiàn)為下降時，則消耗大于積累，消耗大時表現(xiàn)為菌絲生長?？扇苄缘鞍踪|(zhì)和總糖的含量在菌絲生長的積溫期有增長趨勢，而多糖、還原糖則有所下降，此時菌絲生長代謝均表現(xiàn)出相對穩(wěn)定的水平，并維持這一水平，此時并未表現(xiàn)出各營養(yǎng)物質(zhì)的大量積累。營養(yǎng)物質(zhì)的迅速積累發(fā)生在菌袋開孔后，這表明，開孔可刺激黑木耳出耳前期營養(yǎng)物質(zhì)的積累。研究黑木耳不同生長期營養(yǎng)成分的變化規(guī)律，了解不同時期營養(yǎng)積累，為黑木耳催芽及后期出耳提供有效的理論依據(jù)。

∶

[1]陳士瑜.食用菌生產(chǎn)大全[M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1988.

[2]揚新美.中國食用菌栽培學(xué)[M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1988.

[3]叢峰松.生物化學(xué)實驗[M］.上海：上海交通大學(xué)出版社，2005.

[4]陶美華，潘清靈，章衛(wèi)民.藥用真菌多糖含量測定方法研究[J］.中國食用菌，2005，24（5）：37～38.

[5]馮志勇，潘迎杰，陳明杰，等.香菇發(fā)育生理研究進(jìn)展[J］.食用菌學(xué)報，2000，7（4）：53～60.

[6]高君輝，馮志勇，唐利華.杏鮑菇培養(yǎng)階段基質(zhì)理化特性變化的研究[J］.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，25（4）：82～84.