王明月,羅金輝,李建國

1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所;2中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心,?？?571101

HPLC法測定檳榔中的多酚類物質(zhì)

王明月1,2＊,羅金輝2,李建國2

1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所;2中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心,海口 571101

采用高效液相色譜法對檳榔中的多酚類物質(zhì)進行分析。用甲醇提取檳榔中的多酚類物質(zhì),并依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,萃取物經(jīng)抽真空濃縮,流動相定容,高效液相色譜法測定。分析結(jié)果表明:檳榔幼果較檳榔成熟果中所含的多酚種類和數(shù)量少,檳榔成熟果中果仁的多酚種類和數(shù)量都遠較皮中多;檳榔的甲醇提取物乙酸乙酯萃取部分中所含的多酚種類和數(shù)量相比石油醚和正丁醇萃取部分都是最多的;檳榔仁的多酚中含量最多的是兒茶素,含量為 1610 mg/kg,其次是單寧酸 622 mg/kg,表沒食子兒茶素 228 mg/kg,表兒茶素164 mg/kg,表沒食子兒茶素沒食子酸酯 72 mg/kg,沒食子酸 13.6 mg/kg。而沒食子兒茶素、綠原酸、和沒食子兒茶素沒食子酸酯沒有檢測到。

HPLC法;檳榔;多酚類物質(zhì)

Abstract:HPLC was used to determine polyphenols inA reca catechu.Polyphenols were extracted from betel nut with methanol,which were extracted with petroleum ether,ethyl acetate,and n-butanol,successively.Then,the extracts were concentrated and determined by HPLC aftermaking constant volume using the mobile phase.The results showed that the kinds and quantities of polyphenols in mature young betel nutwere fewer than in mature fruit,while those in nuts ofmature fruitwere more than in the skin.The kinds and quantities of polyphenols in the methanol extractwere the most.The content of catechin was the highest reaching 1610 mg/kg in the polyphenols,tannic acid(622 mg/kg),epigallocatechin(228 mg/kg),epicatechin(164 mg/kg),epigallocatechin gallate(72 mg/kg),and gallic acid(13.6 mg/kg)were followed.However,catechin gallate,chlorogenic acid,and gallocatechin gallate were not detected.

Key words:HPLC;A reca catechu;polyphenols

多酚是在植物性食物中發(fā)現(xiàn)的,因具有多個酚基團而得名,是具有潛在促進健康作用的化合物。氧化損傷是導致許多慢性病,如心血管病,癌癥和衰老的重要原因。多酚的強抗氧化功能可以對這些慢性病起到預防作用。檳榔 (A reca catechuL.)中的活性物質(zhì)主要包括生物堿和多酚類[1],近期研究發(fā)現(xiàn)檳榔的 0許多功效如抗細菌、真菌和病毒的作用[2-4];抗老化作用[5];降低膽固醇作用[6,7];抗氧化作用[8],增強纖溶酶活性[9],抗凝血酶作用[10]等都與其所含的多酚有關系。目前對檳榔中生物堿的研究很多,而對檳榔中的多酚類研究較少。測定方法主要是用分光光度法[11,12],只能測定檳榔中多酚的總含量,而無法測定是那種多酚,這對于檳榔的深加工不利。我們利用高效液相色譜法測定了檳榔中的9種多酚類物質(zhì):單寧酸、焦性沒食子酸、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、綠原酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯。這對于檳榔的精深加工,以及引導檳榔產(chǎn)業(yè)發(fā)展,充分利用資源,挖掘其藥用價值,具有重要意義。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters高效液相色譜儀,配 1525泵、717+自動進樣器、2487紫外檢測器、EMPOWER色譜工作站。

單寧酸、焦性沒食子酸、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、綠原酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯。乙腈為色譜純,甲醇、乙酸乙酯、石油醚、正丁醇、冰醋酸為分析純;水為超純水,流動相經(jīng) 0.45 um微孔濾膜減壓過濾。

樣品為樣品海南產(chǎn)檳榔:5月份采摘的嫩果、11月份采摘的成熟果。

1.2 色譜條件

色譜條件:色譜柱:kromasil C18150 mm×4.6 mm(i.d),粒徑 5μm,或相當者。流動相 A:2%冰醋酸水溶液,流動相 B:乙腈,采用梯度洗脫程序:0 min,95%A;18 min,81.5%A;18.5～24.0 min,95%A;用前過 0.45μm濾膜。流速:0.80 mL/min。紫外檢測波長:280 nm。進樣量:10μL。

1.3 標準溶液的配制

檳榔多酚標準儲備液:準確稱取單寧酸、焦性沒食子酸、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、綠原酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯對照品 10 mg,分別置于 10 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容配成濃度為 1 mg/mL的儲備液。

檳榔多酚標準工作溶液的制備:準確量取適量檳榔多酚標準儲備液,用流動相稀釋成濃度分別為5.00、10.00、20.00、40.00、80.00和 160.0μg/mL的檳榔多酚標準工作溶液。

1.4 樣品處理

提取:稱取 10 g(精確至 0.01 g)檳榔樣品,置250 mL錐形瓶中,加 100 mL甲醇,低溫超聲 15 min,濾出濾液后殘渣再加入 50 mL甲醇超聲 10 min,合并濾液,45℃水浴真空濃縮近干。

萃取:①將濃縮物加入 50 mL水混勻,再加入50 mL石油醚萃取兩次,合并石油醚萃取層,30℃水浴真空濃縮近干。

②將①石油醚萃取完后的水層,用 50 mL乙酸乙酯重復萃取兩次,合并乙酸乙酯萃取層,45℃水浴真空濃縮近干。

③將②乙酸乙酯萃取完后的水層,用 50 mL正丁醇重復萃取兩次,合并正丁醇萃取層,80℃水浴真空濃縮近干。

④將③正丁醇萃取完后的水層,70℃水浴真空濃縮近干。

將萃取物①、②、③和④,分別用 乙腈:2%醋酸水溶液 (50∶50)定容至 10 mL,搖勻,經(jīng) 0.45μm濾膜過濾后供高效液相色譜分析。樣品中某種多酚的含量是①、②、③和④萃取部分的該多酚含量的總和。

2 結(jié)果和討論

2.1 流動相的選擇

根據(jù)多酚的性質(zhì)和參考文獻[13-15],本實驗對幾種體系的流動相進行了考察:甲醇-水,乙腈-水,甲醇 -乙 酸 -水 ,甲 醇 -磷 酸 -水 ,乙 腈 -磷 酸 -水 ,乙 腈 -乙酸-水,由于乙腈洗脫能力比甲醇強,而酸的加入抑制了多酚的酚羥基的電離,防止了峰的拖尾,從而使分離達到一個滿意的程度;而且乙酸是弱酸,不會因為加入體積的微小變化,而導致流動相 PH的較大變化,影響分離。比較了 0.3%、2%、5%的乙酸水溶液,當乙酸濃度為 0.3%時,各峰分離度很差;乙酸濃度為 5%時,酸度偏大,對柱子有傷害;乙酸濃度為 2%時,而 PH約為 3.5,在柱子使用的 PH范圍之內(nèi)。結(jié)果表明,以表 1所示梯度表,乙腈-乙酸-水為流動相,乙酸的體積分數(shù)為 2%時,分離檳榔中的多酚,不僅快速、簡單而且分離度好。

表1 流動相梯度表Table 1 Gradient table ofmobile phase

2.2 波長、流速和溫度的選擇

根據(jù)參考文獻[13-15],酚類物質(zhì)大多在 280 nm檢測,可獲得較大的靈敏度,而且不受流動相中其他物質(zhì)的干擾,故選擇 280 nm為檢測波長。

比較了幾個流速:0.5 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min的分離效果,流速為 0.5 mL/min時,各峰之間可以完全分離,但耗時太長;流速為 1.0 mL/min及以上時,沒食子酸和沒食子兒茶素分離度較差;流速為 0.8 mL/min時,18 min已完成 9種多酚的分離,而且分離度符合定量要求。

圖1 多酚標準品和檳榔樣品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of polyphenols standard mixture and sample

柱溫為室溫時,由于采集時間較長,后面洗脫出來的峰的保留時間容易漂移;而柱溫太高 (45℃以上時),時間長了容易損傷柱子;所以選擇柱溫為30℃,既保持了峰的保留時間的重復性,又延長了柱子的壽命。

2.3 回歸方程、相關系數(shù)及檢測限

取 1.3節(jié)系列濃度的檳榔多酚標準工作溶液,按上述色譜條件每種濃度進樣 10μL,以峰面積 Y對標準溶液質(zhì)量濃度 X(g/L)進行線性回歸分析,得檳榔多酚回歸方程和相關系數(shù),見表 2。根據(jù) IUPAC定義,本方法的檢出限為產(chǎn)生響應于 3倍背景噪音的標準偏差分析信號的分析物濃度值。由此可得,檳榔多酚的最小檢出限,見表 2。

2.4 方法準確度和精密度

準確稱取檳榔果樣品兩份,其中一份加入已知量的多酚標樣,另一份不加。在相同條件下測定乙酸乙酯萃取部分 6次,根據(jù)加標樣品測出量減去未加標樣品測出量再除以標準加入量回收率,并用 6次平行測定結(jié)果計算相對標準偏差。試驗結(jié)果證明,本方法有很好的準確度和精密度,可以滿足定量分析要求,見表 3。

表2 回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍和檢測限Table 2 The regression equation,correlation coefficient and detection limit

表3 方法準確度和精密度測定結(jié)果Table 3 Determination results of recovery

表兒茶素 400 未檢出 408±9 99.8～104 0.8沒食子兒茶素沒食子酸酯 400 未檢出 372±19 89.2～97.8 2.9

2.5 樣品分析結(jié)果

將檳榔樣品按 1.4節(jié)進行樣品處理,并按照 1.2節(jié)的色譜條件,測得樣品結(jié)果為:幼果的石油醚萃取部分、正丁醇萃取部分、正丁醇萃取后的水溶液均不含這 9種多酚,乙酸乙酯萃取部分含有兒茶素和表沒食子兒茶素沒食子酸酯,含量分別為 517 mg/kg和 11 mg/kg。而成熟果仁的石油醚萃取部分不含 9種多酚;正丁醇萃取部分含有表沒食子兒茶素15 mg/kg和表沒食子兒茶素沒食子酸酯 5.0 mg/kg;乙酸乙酯萃取部分含有單寧酸、沒食子酸、表沒食子兒茶素、兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素,含量分別為 622 mg/kg、13.6 mg/kg、228 mg/kg、1610 mg/kg、72 mg/kg、164 mg/kg。而成熟果皮中石油醚萃取部分、正丁醇萃取部分、正丁醇萃取后的水溶液均不含這 9種多酚;成熟果皮中乙酸乙酯萃取部分含單寧酸和兒茶素,含量分別為 26.6 mg/kg和 4.22 mg/kg。

3 結(jié)論

本實驗用 HPLC法測定檳榔中多酚類物質(zhì),有效的將 9種多酚分離開,得到的結(jié)果:檳榔幼果較檳榔成熟果中所含的多酚種類和數(shù)量少,檳榔成熟果中果仁的多酚種類和數(shù)量都遠較皮中多;檳榔中所含的多酚類成分主要存在于其甲醇提取物乙酸乙酯萃取部份,而其石油醚、正丁醇萃取部分及萃取后的水中沒有檢測到這 9種多酚;檳榔仁的多酚中含量最多的是兒茶素,達到 1610 mg/kg,其次是單寧酸622 mg/kg,表沒食子兒茶素 241 mg/kg,表兒茶素164 mg/kg,表沒食子兒茶素沒食子酸酯 77 mg/kg,沒食子酸 13.6 mg/kg。而沒食子兒茶素、綠原酸、和沒食子兒茶素沒食子酸酯沒有檢測到。

1 Zhang CJ(張春江),Lv FJ(呂飛杰 ),Tao HT(陶海騰).The research progressof active ingredient in betel nut and its functional role.Food Nutr China(中國食物與營養(yǎng)),2008,6:50-53.

2 Xiao PG(肖培根 ).Modern Chinese MaterialMedica(新編中藥志).Beijing:Chemical Industry Press,2002:643-647.

3 HuangBB(黃冰冰 ),Fan MW(樊明文 ),Yang XL(楊祥良),et al.The impact of Chinese herbal medicine on the growth of periodontal bacteria.J Four Mil Med Univ(第四軍醫(yī)大學學報),2003,24:424-426.

4 Xiao Y(肖悅),Liu TJ(劉天佳 ),Huang Z W(黃正蔚 ),et al.The impact of 5 kinds of natural drugs on Streptococcus mutans in saliva of acquired membrane adhesion.J Sichuan Univ,Med Ed(四川大學學報,醫(yī)學版),2004,35:687-689.

5 Lee KK,Cho JJ,Choi JD.Anti-elastase and anti-hyalunon idase of phenolic substance from areca catechu as new antiageing agent.Int J Cosmet Sic,2001,23:341-346.

6 Jeon S M,Kim HS,Lee TG,et al.Lower absorption of cholesteryloleate in rats supplem ented with areca catechul extract.Ann NutrM etab,2000,44:170-176.

7 Byun SJ,Kim HS,Jeon S M,et al.Supplem entation of areca catechu L.ettract alters triglyceride absorption and cholesterolm etabolism in rats.Ann Nutr Metab,2001,45:279-284.

8 Guota PC,Wamaku lasuriya S.Globalepide miology of areca nut usage.AddictB iol,2002,(7):77-83.

9 YuWJ(愈文杰).Observation of 21 kinds of Chinese medicine on the role of fibrinolysis in vitro observation.J Integr TraditW estMed(中西醫(yī)結(jié)合雜志),1986,6:484.

10 Ou XC(歐興長),DingJX(丁家欣),ZhangL(張玲).Journal of Integrated Traditional andWesternMedicine.Chinese Tradic HerbMed(中草藥),1987,18(40):21.

11 Wang JK(王進昆),Sun LX(孫路西).Betel quid in the analysis of phenolic compounds.Chin Agric Chem Soc(中國農(nóng)業(yè)化學會志),1993,31:623-632.

12 Zhang CJ(張春江),Lv FJ(呂飛杰),Tai JX(臺建祥),et al.Fruit and nut products in the totalphenol and tannin content dete rmined.Food Res Dev(食品研究與開發(fā)),2008,6:119-121.

13 Chen L(陳磊 ),Yang JL(楊建榮 ),Huang XS(黃雪松 ).Determination of 6 kindsofpolyphenols in Fuji apple pomace by HPLC.Food Ferment Ind(食品與發(fā)酵工業(yè)),2008,34(8):158-161.

14 Sun HF(孫海峰),Lv HT(呂海濤),Zhou SS(周莎莎),et al.Dete rmination of polyphenols in apple juice concentrate by HPLC.Food Sci(食品科學),2008,29:314-317

15 Zhang JF(張晉芬),Yuan B(袁冰 ),Leng P(冷平),et al.Determination of 8 kinds of Polyphenols in pears,apples and bananaswith the microwave extraction and high-perfo rmance liquid chromatography.J Anal Test(分析測試學報),2008,27:1371-1374.

Determ ination of Polyphenolsin Areca catechuby HPLC

WANG Ming-yue1,2＊,LUO Jin-hui2,L IJian-guo2

1Analysis and testing centre,Chinese Academic of Tropical Agricultural Sciences;2B iotechnology Research Institute of Tropical,Chinese Academic of Tropical Agricultural Sciences,Hainan 571101,China

TS207.3

A

1001-6880(2011)01-0101-04

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