郭 霞,盛 磊,木合布力·阿布力孜,阿布力孜·阿布杜拉

1新疆醫(yī)科大學(xué)新疆地方病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室;2新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥化有機(jī)教研室;3新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)暨分子生物學(xué)教研室,烏魯木齊 830011

新疆脹果甘草總黃酮的細(xì)胞毒活性研究

郭 霞1,盛 磊1,木合布力·阿布力孜2,阿布力孜·阿布杜拉3＊

1新疆醫(yī)科大學(xué)新疆地方病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室;2新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥化有機(jī)教研室;3新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)暨分子生物學(xué)教研室,烏魯木齊 830011

為了探討新疆脹果甘草總黃酮 (general flavonoids,GFs)對宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性,自制備脹果甘草GFs,通過離子阱噴霧式質(zhì)譜技術(shù)分析,建立 GFs組分的指紋圖譜;并且對 SiHa宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行 GFs藥物干預(yù),應(yīng)用MTT法和流式細(xì)胞技術(shù)分別鑒定細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡率。獲得了新疆脹果甘草 GFs組分的特征性指紋圖譜,提取物中 GFs含量可達(dá) 35.40%;發(fā)現(xiàn)在 0～500μg/mL GFs濃度范圍內(nèi),GFs藥物干預(yù)引起細(xì)胞活力梯度性下降,其MTT法檢出的最低值為 12%;在 0～1000μg/mL GFs濃度范圍內(nèi),GFs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)梯度性上升趨勢,其流式細(xì)胞儀檢出的最高值為 78%。結(jié)果表明新疆脹果甘草 GFs具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性,能夠抑制宮頸癌細(xì)胞生長與活力,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

新疆脹果甘草;總黃酮;細(xì)胞毒活性

Abstract:To investigate the cytotoxic activity of general flavonoids(GFs)from XinjiangGlycyrrhiza inflataBat,on cervical carcinoma cells.GFswas prepared fromGlycyrrhiza inflata,and the finger printmap was characterized by Electro Spray Mass Spectrometry;SiHa cervical carcinoma cellswere treatedwith GFs,and the cell viability and cellular apoptosiswere deter mined byMTTmethod and flow cytometry,respectively.We discovered that GFs from XinjiangGlycyrrhiza inflatahad special finger print characteristics;the content of flavonoids in the extractwas 35.40%;in the dose range of 0-500μg/mL GFs,the cell viability dropped gradually with the GFs treatment,and the lowest level by MTT detection was 12%;in the dose range of 0-1000μg/mL GFs,the ratio of cellular apoptosis induced by GFs increased gradually,and the highest level by flow cytometry detection was up to 78%.GFs from XinjiangGlycyrrhiza inflatahad relatively high cytotoxic activity including the inhibition of cell growth and viability aswell as the induction of cellular apoptosis.In conclusion,thiswork may provide important evidence for further screening and isolation of active ingredients of flavonoids aswell as the development of new natural anti-cancer drugs.

Key words:XinjiangGlycyrrhiza inflata;general flavonoids(GFs);cytotoxic activity

甘草 (Glycyrrhizaroot,維語名為 Ququk buya,Bihsus)作為君藥在維吾爾醫(yī)藥諸多復(fù)方制劑中占有一定比例,尤其是維吾爾醫(yī)學(xué)用于調(diào)節(jié)四種異常體液的異常黑膽質(zhì)成熟劑——復(fù)方木尼孜其顆粒[國藥準(zhǔn)字 Z65020166]含有可觀比例的甘草成分[1]。甘草中的化學(xué)成分有三萜類、黃酮類、多糖類等,其中黃酮類成分可達(dá) 150余種,其中異甘草素、甘草素和甘草查耳酮 A有明顯的抗氧化、抗炎和雌激素活性,在體外試驗中能夠抑制前列腺癌、乳腺癌和肝癌細(xì)胞生長[2]。有人推測,甘草黃酮類成分可能對雌激素依賴性腫瘤具有較強(qiáng)的抗癌活性。宮頸癌是婦科惡性腫瘤,但是甘草黃酮類化合物對宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性尚未見文獻(xiàn)報道。

本研究從新疆脹果甘草中制備甘草總黃酮(general flavonoids,GFs),分析其質(zhì)譜指紋圖譜;通過 SiHa宮頸癌細(xì)胞的藥物干預(yù)及細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡率鑒定,評價該藥的抗宮頸癌細(xì)胞毒活性,為從新疆地區(qū)特色植物脹果甘草研發(fā)抗癌新藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試藥

主要使用的儀器有離子阱電噴霧式質(zhì)譜儀(LCQ-ESI-MS,Ther mo Fishers公司),CO2孵育箱(Hera Cell-150,Ther mo公司),生物安全柜 (Thermo KS-18,Ther mo公司 ),酶標(biāo)儀 (Beckmann Coulter公司)和流式細(xì)胞儀 (LSR II,BD公司)。SiHa細(xì)胞由中國科學(xué)院上海分院細(xì)胞庫提供。RPM I1640培養(yǎng)基、胎牛血清 (FBS)、抗菌素和胰蛋白酶、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-5-二苯基四氮唑溴鹽 (MTT)、二甲基亞砜 (DMSO)等試劑均購自 Sigma和 Invitrogen公司。Annexin V-FITC試劑盒是 Calbiochem公司產(chǎn)品。

1.2 脹果甘草 GFs的制備

新疆脹果甘草 (Glycyrrhiza inflateBat.)從新疆甘草基地——巴楚縣采摘并鑒定。脹果甘草 GFs從甘草根提取精制,其制備方法在研究組成員以往發(fā)表的文獻(xiàn)中詳細(xì)說明[3]。

1.3 GFs的含量測定

精制的脹果甘草 GFs的黃酮含量測定參照文獻(xiàn)[3]。

1.4 離子阱電噴霧式質(zhì)譜儀分析

利用離子阱電噴霧式質(zhì)譜儀建立新疆甘草 GFs的指紋圖普,質(zhì)譜分析條件參照該儀器最佳技術(shù)指標(biāo),主要參數(shù)有電噴霧離子化 (ESI)源,毛細(xì)管溫度為 150℃,脫溶劑氣 (N2)流速為 350 L/h,錐孔氣(N2)流速為 50 L/h,毛細(xì)管電壓為 3.5 kV,掃描范圍m/z:200～1000/50～350,錐孔電壓為 30 V和 60 V,碰撞氣體為氬氣 (Ar),碰撞室能量為 30 V。

1.5 樣品溶液的制備

將 GFs以 100%DMSO溶解后,用 RPM I1640培養(yǎng)基將藥品稀釋成各種我們所需的濃度,使每個樣品的 DMSO濃度控制在 0.5%,經(jīng) 0.22μm過濾器除菌后使用,并將 GFs重量與溶液體積之比定為藥物濃度。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)

配制含 10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的 RP M I1640全培養(yǎng)基,在 5%CO2和37℃條件下培養(yǎng) SiHa細(xì)胞,每隔 2～3 d更換培養(yǎng)基,待細(xì)胞融合度達(dá) 80%時,用胰蛋白酶 (0.25%)消化法以 1∶3或 1∶4比例傳代。

1.7 MTT法測定細(xì)胞活力

取對數(shù)生長期的 SiHa細(xì)胞,接種于 96孔板 (密度為 2×105個 /mL),每孔 200μL,按預(yù)定濃度進(jìn)行藥物干預(yù) 20～24 h(經(jīng)過預(yù)實(shí)驗證明在藥物干預(yù) 16～48 h之內(nèi),MTT測定結(jié)果變化不大,藥物作用時間對結(jié)果影響不大)。次日,每孔加入 20μL MTT(5 mg/mL),并保持培養(yǎng)基的原體積不變。在 37℃和5%CO2細(xì)胞孵育箱培養(yǎng) 4 h后,棄去培養(yǎng)基,用 150 μL DMSO溶解細(xì)胞。待細(xì)胞內(nèi)紫色結(jié)晶溶解后,利用酶標(biāo)儀測定其 570 nm處吸光度值 (OD570),計算細(xì)胞存活率,并判斷細(xì)胞活力。實(shí)驗獨(dú)立重復(fù)六次,計算平均值,運(yùn)用 SPSS.17.0軟件 t檢驗方法進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

選擇對數(shù)生長期的 SiHa細(xì)胞,以 1×106細(xì)胞 /孔的密度種植于 6孔板,培養(yǎng) 20～24 h和細(xì)胞融合度達(dá)到 70%～80%后,按預(yù)定濃度加入藥物并繼續(xù)培養(yǎng)。待藥物干預(yù)結(jié)束后,收集細(xì)胞,參照 Annexin V-FITC試劑盒說明書處理細(xì)胞,并在流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率,主要包括細(xì)胞懸浮、結(jié)合 Annexin VFITC(1.25μL)和碘化丙啶 (PI,10μL),以及流式細(xì)胞儀檢測。流式細(xì)胞儀分析條件:激發(fā)波長 Ex=488 nm;發(fā)射波長 Em=530 nm。實(shí)驗獨(dú)立重復(fù)三次,計算平均值,運(yùn)用 SPSS.17.0軟件 t檢驗方法進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 脹果甘草 GFs的含量測定

GFs為淡黃色粉末,GFs含量為 35.4%,與FeCl3反應(yīng)顯棕色。

2.2 脹果甘草 GFs的離子阱噴霧式質(zhì)譜 (ESI-MS)分析

通過 ESI-MS全掃描分析,獲得脹果甘草 GFs化學(xué)成分的指紋圖譜 (圖 1)。根據(jù)質(zhì)合比推測,在甘草 GFs組分中可能含有異甘草素和甘草查爾酮A,分別與峰位值 256.25和 339.23相對應(yīng)。

2.3 脹果甘草 GFs對 SiHa細(xì)胞生長與活力的影響

GFs主要含有脂溶性化合物,易溶于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)試劑 DMSO。經(jīng) SiHa細(xì)胞毒性試驗,我們將用于細(xì)胞藥物干預(yù)的 DMSO終濃度范圍定為 0.5+1.0%。以往的文獻(xiàn)報道選擇 490 nm為 MTT法檢測波長。但是,我們多次測定后,發(fā)現(xiàn) GFs在 570 nm波長處的自身光吸收值較低。

圖1 新疆脹果甘草 GFs的 ESI-MS質(zhì)譜特征Fig.1 ESI-MS Characteristics of GFs from XinjiangGlycyrrhiza inflata

在 0～500μg/mL GFs的藥物濃度范圍內(nèi),隨著GFs濃度的增高,發(fā)現(xiàn) SiHa細(xì)胞的活性梯度性下降(表 1)。經(jīng)多次試驗,我們發(fā)現(xiàn)濃度在 150μg/mL GFs以內(nèi),檢測結(jié)果具有很好的劑量-效應(yīng)關(guān)系 (圖3),并且 50μg/mL GFs是 SiHa細(xì)胞的最敏感濃度,濃度超過 150μg/mL GFs可以觀察到 GFs自身吸收對檢測信號的干擾。MTT方法鑒定結(jié)果反映了 GFs對細(xì)胞生長、繁殖、活性和細(xì)胞凋亡等綜合效應(yīng),并證明該藥具有潛在的抗宮頸癌活性。

表1 運(yùn)用MTT方法檢測新疆脹果甘草 GFs藥物干預(yù)對 Si-Ha細(xì)胞生長與活力的影響Table 1 Effects of GFs from XinjiangGlycyrrhiza inflataon Si-Ha cell growth and viability byMTTmethod

a平均值,設(shè)置 6次重復(fù);b各組平均OD570值對正常對照組的百分比;+該組OD570值與正常對照組相比,其差異顯著 (x±s,P＜0.05);+高濃度 GFs在 570 nm處有光吸收。

2.4 流式細(xì)胞儀方法鑒定脹果甘草 GFs誘導(dǎo)的 Si-Ha細(xì)胞凋亡率

通過熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞儀鑒定,可以直接評價細(xì)胞凋亡水平,并有利于消除黃酮類化合物自身光吸收的干擾。在 0+1000μg/mL GFs范圍內(nèi)進(jìn)行SiHa細(xì)胞藥物干預(yù)與鑒定,發(fā)現(xiàn)從起始濃度 100 μg/mL GFs開始,該藥就引起細(xì)胞凋亡,其細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度增大而升高,并且具有較好的量效關(guān)系,最高凋亡率可達(dá) 78%(圖 2、3與表 2)。GFs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)與MTT法鑒定所提供的細(xì)胞活力變化趨勢相吻合,進(jìn)一步證明脹果甘草 GFs具有較強(qiáng)的抗癌活性。

表2 運(yùn)用流式細(xì)胞方法檢測新疆脹果甘草 GFs藥物干預(yù)對 SiHa細(xì)胞凋亡的影響Table 2 Effects of GFs from XinjiangGlycyrrhiza inflataon Si-Ha cell apoptosis by FACSmethod

3 討論

國內(nèi)外對植物來源的抗癌活性成分的研究由來已久,從不同角度和程度揭示了某些植物類抗癌活性藥物的可能作用機(jī)制。黃酮類化合物是一類低分子天然植物成分,有共同的母核 C6+C3+C6,包括黃酮類、黃酮醇類、異黃酮類、查爾酮類、雙氫黃酮類、雙氫查爾酮類等,具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、改善心血管功能、提高免疫力等廣泛的生物學(xué)活性[4,5]。多種植物 GFs可以抑制細(xì)胞生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,是黃酮類化合物抗腫瘤的重要機(jī)理之一[6]。

在尋找高效低毒的天然物質(zhì)方面,甘草已成為倍受關(guān)注的植物之一。在甘草屬植物中發(fā)現(xiàn)的黃酮類成分達(dá) 150多種。新疆地區(qū)擁有豐富的野生甘草資源和人工栽培基地,在甘草黃酮類化合物的提取工藝、成分鑒定和藥理作用方面也有一些研究報道[3,7,8]。揭示甘草黃酮類化合物的抗癌作用機(jī)制,對單體活性組分的篩選與鑒定具有指導(dǎo)意義。

本研究選用新疆脹果甘草 GFs,其黃酮含量達(dá)35.4%。通過 ESI-MS質(zhì)譜分析,對新疆脹果甘草GFs的指紋圖譜進(jìn)行鑒定,可以推測出異甘草素和甘草查爾酮 A等抗癌活性組分的存在。細(xì)胞藥物干預(yù)實(shí)驗和 MTT方法檢測結(jié)果顯示,在 25～100 μg/mL GFs范圍時,就能對 SiHa宮頸癌細(xì)胞生長與活力產(chǎn)生抑制效應(yīng),其活力下降至 12%。為了進(jìn)一步鑒定該藥物對腫瘤細(xì)胞凋亡的單獨(dú)作用,我們應(yīng)用Annexin V熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞儀技術(shù)分析細(xì)胞凋亡率,發(fā)現(xiàn)在 100～1000μg/mL GFs范圍內(nèi),該藥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其最高凋亡率達(dá) 78%。通過細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡的分析,我們認(rèn)為新疆脹果甘草 GFs含有抗癌活性成分,能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長、繁殖和活力,引起細(xì)胞凋亡。通過本課題研究,對脹果甘草GFs抗腫瘤生物活性做出了初步評價,為新疆脹果甘草 GFs活性組分的進(jìn)一步篩選、分離以及從中研發(fā)新型抗癌藥提供重要依據(jù)。

1 Pharmacopoeia of Uighur Medicine(維吾爾藥志).Xinjiang:Xinjiang Publishing House of Science,Technology and Medicine,1999.185.

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Cytotoxic Activity of Flavonoids from Xinjiang Glycyrrhiza in flata Bat.

GUO Xia1,SHENG Lei1,Mourboul ABL ISE2,Abulizi A BUDULA3＊

1Xinjiang Key Laboratory of Molecular Biology and Endem ic Diseases;2Departm ent of Phar maco-chem istry;3Depar tm ent of Biochem istry and B iology,Basic Medical College,Xinjiang Medical University,U rum qi 830011,China

R931.6;Q949.751.9

A

1001-6880(2011)01-0049-05

2009-08-10 接受日期:2010-08-25

新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗室基金 (XJDX0208-2006-02)

＊通訊作者 Tel:86-991-4366435;E-mail:abulizi de@126.com