何俊杰,鄭煉付,霍天武,王婷婷,曾和平

華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,廣州 510640

馬纓丹根:化學(xué)成分及抑制 H IV逆轉(zhuǎn)錄酶活性

何俊杰,鄭煉付,霍天武,王婷婷,曾和平＊

華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,廣州 510640

用硅膠柱層析分離馬纓丹 (Lantana camaraL.)根部乙醇浸提物獲得 25個(gè)組分,其中三個(gè)組分對(duì) H IV逆轉(zhuǎn)錄酶 (H IV reverse transcriptase,H IV RT)活性有抑制作用。使用減壓柱層析從部分組分中分離獲得了 6個(gè)五環(huán)三萜類化合物,它們的結(jié)構(gòu)經(jīng)波譜分析分別鑒定為齊墩果酮酸 (oleanonic acid,1)、路路通內(nèi)酯 (liquidambaric lactone,2),馬纓丹烯 A(lantadene A,3)、馬纓丹烯 B(lantadene B,4)、齊墩果酸 (oleanolic acid,5)和 25-羥基 -齊墩果酸 (25-hydroxy-oleanolic acid,6)。其中,化合物 2和 6首次從馬鞭草科植物中分離得到,同時(shí),首次報(bào)道了化合物 6的單晶結(jié)構(gòu)。

馬纓丹根;H IV逆轉(zhuǎn)錄酶;五環(huán)三萜類化合物;單晶結(jié)構(gòu)

Abstract:Among the 25 fractions obtained from the alcohol extractive of the roots ofLantana cam araL.(Verbenaceae)by silica gel column chromatography,three fractions demonstrated inhibitory H IV-1 reverse transcriptase activity.Further more,six pentacyclic triterpeneswere isolated by reduced pressure column chromatography and identified asoleanonic acid(1),liquidambaric lactone(2),lantadene A(3),lantadene B(4),oleanolic acid(5),and 25-hydroxy-oleanolic acid(6)by spectral analysis.Compounds 2 and 6 were reported firstly in the plants of Verbenaceae family,and the structure of 6 was confirmed firstly by X-ray crystallography.

Key words:roots ofLatana camara L.;H IV RT;pentacyclic triterpenes;single crystal structure

馬纓丹 (Lantana camaraLinn.)系馬鞭草科馬纓丹屬直立或蔓性灌木,世界十大有害雜草之一[1,2];主要分布在我國(guó)東南沿海城市,近年來在野外迅速蔓延,嚴(yán)重破壞生態(tài)系統(tǒng)[3,4]。因此,深入探究馬纓丹的化學(xué)成分是開發(fā)利用該植物從而有效控制其種群數(shù)量的先決條件。

馬纓丹具有廣泛的藥用價(jià)值,莖干有發(fā)汗、解熱、驅(qū)風(fēng)、解痙和止痛的作用[5],在該植物內(nèi)發(fā)現(xiàn)了用于肝炎臨床輔助治療的齊墩果酸和烏蘇酸,其根部酒精浸提物還有解眼鏡蛇毒的功效[6]。潘文斗[6,7]和朱峰[8]等先后研究了其根部酒精浸提物中能溶于甲醇的大極性化合物和揮發(fā)油成分,然而,中等極性部位化學(xué)成分的研究還未曾報(bào)道。為了更深入的研究其根部化學(xué)成分,本文對(duì)其根部中等極性成分進(jìn)行研究,從其根部乙醇浸提物中得到 6個(gè)五環(huán)三萜類化合物,分別為齊墩果酮酸 (1)、路路通內(nèi)酯 (2),馬纓丹烯 A(3)、馬纓丹烯 B(4)、齊墩果酸(5)和 25-羥基-齊墩果酸 (6)。化合物 2和 6首次從該科植物中獲得,化合物 2較為少見,其生物活性研究還未見報(bào)道,化合物 6對(duì)癌癥有一定程度的抑制作用[9]。為了證實(shí)化合物 6的空間構(gòu)型,我們獲得了該化合物的單晶結(jié)構(gòu) (劍橋數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào):CCDC 768076)。首次對(duì)馬纓丹 H IV RT抑制物的研究表明馬纓丹對(duì) H IV RT活性有抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

熔點(diǎn)用 X-4顯微熔點(diǎn)儀測(cè)定 (未校正),紅外光譜用 Bruker TensoR27紅外光譜儀 (KBr壓片),MS采用 Esquire HCT PLUS型質(zhì)譜儀和測(cè)定,HRMS用英國(guó)VG公司 ZAB-HS型雙聚焦磁質(zhì)譜測(cè)定 (EI源),NMR譜用 VAR IAN INOVA-400核磁共振儀測(cè)定 (T MS為內(nèi)標(biāo)),單晶衍射數(shù)據(jù)采用 Rigaku/MSC Mercury CCD單晶衍射儀測(cè)定。所用 GF254和 H型薄層層析硅膠及柱層析硅膠均為青島海洋化工廠生產(chǎn),乙酸乙酯、石油醚為廣東光華化學(xué)廠有限公司產(chǎn)品。使用 EnzChek逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒 (E-22064)進(jìn)行H IV逆轉(zhuǎn)錄酶活性的測(cè)定。

1.2 植物來源、提取和分離

馬纓丹根部于 2009年 3月份采自華南理工大學(xué)校園內(nèi),由華南師范大學(xué)植物學(xué)教授王小菁鑒定,標(biāo)本編號(hào) G-1,收藏于本實(shí)驗(yàn)室。

將 1.7 kg新鮮馬纓丹根用鍘刀切片后放入5000 mL廣口瓶中,用 95%酒精浸泡 4個(gè)月,過濾,浸提液減壓濃縮得浸膏,浸膏用已填裝 30 cm高硅膠 (100～200目)的層析柱 (4.5×45 cm)進(jìn)行分離。先用石油醚洗脫除脂,再以石油醚-乙酸乙酯 (76∶24)洗脫,定量收集,用薄層層析 (展開劑均為石油醚-乙酸乙酯)檢驗(yàn)合并相同流分,濃縮,獲得組分 F1～F12;石油醚-乙酸乙酯 (60∶40)洗脫得組分 F13～F15,100%乙酸乙酯洗脫得組分 F16～F25。F2做減壓柱層析獲得 F2A～F2F,F2D和 F2E在乙醇和二氯甲烷中反復(fù)重結(jié)晶分別得到 1(40 mg)和 2(40 mg)。F3于石油醚-乙醇中反復(fù)重結(jié)晶獲得 3(500 mg)。F4和 F5做硅膠柱層析后,再用石油醚-乙酸乙酯反復(fù)重結(jié)晶后獲得 4(200 mg)。F6用薄層層析硅膠 H做減壓柱層析后再用乙醇中做分步結(jié)晶獲得 5(120 mg),在乙醇中對(duì) F15做分步結(jié)晶,獲得 6(16 mg)及其單晶。

1.3 抑制 H IV RT活性組分的篩選

在 25個(gè)組分當(dāng)中選擇了 F3～F11,F21～F25共十一個(gè)組分,以及對(duì)照品齊多夫定 (AZT)和依非韋倫 (Efavirenz),所有樣品濃度均配制為 1μmol/mL,然后用 EnzChek逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒,按照文獻(xiàn)[12]所述方法進(jìn)行測(cè)定,然后以 Efavirenz對(duì) H IV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制率為 100%,分別計(jì)算各組分相對(duì)于 Efavirenz的抑制率。

2 結(jié)果和討論

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)

2.1.1 路路通內(nèi)酯 (liquidambaric lactone,2)

無色透明晶體,mp.＞300℃。APCI-MS顯示分子峰[M]+468,I R吸收信號(hào)說明環(huán)內(nèi)酯羰基及酮羰基的存在,這被13C NMR進(jìn)一步證實(shí)。13C NMR信號(hào)集中在 10～60 ppm之間,1H NMR顯示有 7個(gè)甲基,推測(cè)該化合物為三萜類化合物并確定了其齊墩果烷型碳骨架。13C NMR證明該化合物不含sp2碳原子,與齊墩果酮酸在 C-12和 C-13之間是雙鍵的結(jié)構(gòu)不同,推測(cè)該位置雙鍵與羧酸形成內(nèi)酯結(jié)構(gòu),同時(shí)解釋了13C NMR中 87.4 ppm處的信號(hào)。90°DEPT譜顯示了五個(gè)次甲基,應(yīng)以齊墩果酮酸結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)在兩個(gè)亞甲基上增加取代基。1H NMR中 3.07 ppm處有兩個(gè) H,HSQC顯示1H NMR中 3.07 ppm的兩個(gè)氫分別屬于化學(xué)位移為 57.7 ppm和 52.5 ppm的兩個(gè)叔碳,I R沒有醇羥基氫的吸收,推測(cè)存在環(huán)氧結(jié)構(gòu)。參考文獻(xiàn)[10],鑒定了該化合物。

2.1.2 25-羥基-齊墩果酸 (25-Hydroxy-oleanolic acid,6)

無色透明方晶體,IR吸收說明存在羰基和碳碳雙鍵。其13C NMR和1H NMR數(shù)據(jù)同齊墩果酸較為相似,兩者的碳骨架相同。1H NMR顯示只有 6個(gè)甲基接在季碳上,同時(shí) 3.7 ppm左右處增加了 2個(gè) H的多重峰,故考慮一個(gè)甲基被羥基所取代,羥基質(zhì)子對(duì)應(yīng) 4.22 ppm處的三重峰?；衔?6在 20 ppm以下只有三個(gè)信號(hào),故推測(cè)被取代的甲基應(yīng)為 24-C、25-C或 26-C中的一個(gè)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證該化合物的立體構(gòu)型,我們培養(yǎng)了其單晶,做了 X-衍射實(shí)驗(yàn)。經(jīng)解析該化合物的單晶 X-衍射數(shù)據(jù)得到其分子式 C30H48O4,Mr=472.68:晶體屬正交晶系 (Orthorhombic):晶胞參數(shù):a=12.2744(12)nm,b=13.7679(13)nm,c=15.5493(14)nm:α =90.00°,β =90.00°,γ =90.00°:V=2627.7(4)nm3,Dc=1.195 g/cm3,Z=4,F(000)=1040,μ =0.077 mm-1。R1=0.0498,ωR2=0.0940。

2.1.3 化合物 1、3、4和 5的結(jié)構(gòu)

將化合物 1、3 、4和 5的熔點(diǎn)、I R、MS、1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)[6,11]對(duì)比,確認(rèn)化合物 1為齊墩果酮酸,化合物 3為馬纓丹烯 A,化合物 4為馬纓丹烯B,化合物 5為齊墩果酸。

2.2 各組分對(duì) H IV RT活性抑制作用

馬纓丹根部酒精浸提物經(jīng)硅膠柱層析分離獲得組分 F1～F25,再以 Efavirenz為陽性對(duì)照 (抑制率100%),AZT為陰性對(duì)照,測(cè)定并計(jì)算了 F3～F7、F10～F11、F23～F25共十一個(gè)組分的相對(duì)抑制率,相對(duì)抑制率高于 AZT即表示有抑制作用。結(jié)果顯示,F6,F7和 F11,三個(gè)組分對(duì) H IV RT活性有一定抑制作用,作用最明顯的是組分 F6,見圖 1。三個(gè)組分當(dāng)中的單一化合物對(duì) H IV RT的抑制作用正待深入研究。

圖1 各組分濃度為 1μmol/mL時(shí)對(duì) H IV RT的相對(duì)抑制率Fig.1 Relative inhibitory rate of each fraction on H IV RT at a concentration of 1μmol/mL

3 結(jié)構(gòu)鑒

化合物 1 銀白色針狀晶體 (乙醇-二氯甲烷),產(chǎn)率 0.002%,mp.167～168℃:APCI-MSm/z:454[M]-1。H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:5.34～5.26(1H,br,12-H),2.83(1H,dd,J=13.6,3.72 Hz,18-H),2.55(1H,m,2β-H),2.37(1H,m,2α-H),1.14,1.08,1.05,1.03,0.93,0.91,0.80(8×CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:15.0,17.0,19.5,21.4,22.8,23.4,23.5,25.8,26.4,27.6,30.7,32.1,32.4,33.0,33.8,34.1,36.8,39.1,39.2,40.9,41.7,45.8,46.6,46.8,47.4,55.2,122.3,143.6,184.2,217.8;I R(KBr)ν:3500～3100,2955,1731,1665,1490,750 cm-1。

圖2 化合物 1～6的結(jié)構(gòu)Fig.2 Compounds 1-6 isolated fromLantana camara

化合物 2 無色透明晶體 (乙醇-二氯甲烷),產(chǎn)率0.002%,mp.＞300℃:APCI-MSm/z:468[M]+。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:3.07(2H,br,11β,12β-H),2.67(1H,m,21β-H),2.44(1H,m,21α-H),2.34(1H,d,J=13.7 Hz,18-H),2.23 ～2.08(1H,m,2-H),1.87(1H,t,J=13.5 Hz,1-H),1.19,1.10,1.06,1.00,0.93(5×CH3),1.12(6H,br,2 ×CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:16.4,18.7,18.7,19.8,21.1,21.2,23.6,25.9,26.7,26.9,30.4,31.4,33.2,33.8,34.2,36.2,37.7,38.6,40.5,41.2,43.8,47.6,49.5,50.0,52.5,54.7,57.0,87.4,179.3,216.3;IR(KBr)ν:3065～2854,1768,1691,1601,1449,760 cm-1。

化合物 3 無色透明方晶 (乙醇-石油醚),產(chǎn)率0.029%,mp.292～293℃:ESI-MSm/z:553[M+1]+。1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:6.00(1H,q,J=7.2 Hz,33-H),5.38(1H,br,12-H),5.09(1H,s,22α-H),3.05(1H,dd,J=13.7,3.6 Hz,18-H),2.56(1H,m,2β-H),2.37(1H,m,2α-H),1.77,1.18,1.09,1.06,1.05,1.00,0.90,0.83(8×CH3),1.98(3H,d,J=7.4 Hz,34-CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:15.1,15.1,15.6,16.8,19.4,20.6,21.4,23.5,24.2,25.8,26.1,26.4,27.5,30.0,32.1,33.7,34.1,36.7,37.6,38.3,39.0,39.2,41.9,45.9,46.8,47.4,50.5,55.2,75.8,122.4,127.5,139.0,143.1,166.2,180.4,217.7;IR(KBr)ν:3700～2800,1710,1645,1460,1383,1229,1148 cm-1。

化合物 4 無色透明方晶 (乙酸乙酯-石油醚),產(chǎn)率 0.012%,mp.260～262℃;FAB-MSm/z:575[M+Na]+,553[M+H]+,535[M+H2O]+,452[M+C5H8O2]+,407,83(100%):HRESI-MS calcd for C35H52O5[M]+552.3809,found 552.3805。 IR(KBr)ν:3282,2950,1738,1711,1650,1462,1385,1229,1139 cm-1。1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:5.57(1H,d,J=1.2 Hz,33-H),5.39(1H,t,J=3.4 Hz,12-H),5.05(1H,t,J=3.0 Hz,22α-H),3.03(1H,dd,J=13.8,4.1 Hz,18-H),2.56(1H,m,2β-H),2.37(1H,m,2α-H),1.18,1.09,1.07,1.05,1.01,0.89,0.85(7×CH3),2.14(3H,d,J=1.0 Hz,34-CH3),1.84(3H,d,J=1.0 Hz,35-CH3):13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:15.2,16.9,19.5,20.2,21.5,23.6,24.1,25.8,26.3,26.5,27.4,27.6,30.1,32.3,33.7,34.1,36.8,37.6,38.6,39.2,39.2,42.1,46.0,46.9,47.4,50.6,55.3,75.2,116.0,122.4,143.1,157.0,165.3,178.7,217.7。

化合物 5 針狀晶體 (乙醇),產(chǎn)率 0.007%,mp.289～290 ℃.1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:5.28(1H,t,J=3.4 Hz,12-H),3.22(1H,dd,J=11.1,4.5 Hz,3-H),2.82(1H,dd,J=13.7,4.2 Hz,18-H),1.13,0.98,0.93,0.91,0.90,0.77,0.74(7×CH3;13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:15.3,15.5,17.1,18.3,22.9,23.4,23.6,25.9,27.1,27.6,28.1,30.7,32.4,32.6,33.1,33.8,37.1,38.3,38.7,39.2,40.9,41.5,45.8,46.5,47.6,55.2,79.0,122.6,143.6,183.8;I R(KBr)ν:3470,3058,2928,1693,1610,1490,1450 cm-1;ESI-MSm/z:456[M]-。

化合物 6 無色透明方晶 (乙醇),產(chǎn)率0.0009%,mp.181～183℃;ESI-MSm/z:472[M]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:5.11(1H,t,J=3.4 Hz,12-H),4.28(1H,d,J=5.2 Hz,3-OH),4.22(1H,t,J=4.6 Hz,25-OH),3.75(2H,m,25-H),3.01(1H,m,3-H),2.72(1H,dd,J=13.7,4.07 Hz,18-H),1.07,0.90,0.83,0.70(4×CH3),0.87(6H,2×CH3);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:16.7,17.9,18.2,23.0,23.8,23.8,25.0,26.5,27.7,28.3,29.4,30.8,32.6,33.2,33.3,33.5,33.7,38.8,41.2,41.2,41.9,45.8,46.1,48.6,55.4,59.7,77.6,123.0,143.6,179.1;I R(KBr)cm-1:3454,2935,2859,1693,1624,1450,1025。

選取化合物 6的單晶,大小為 0.26 mm×0.22 mm ×0.16 mm,用 Rigaku/MSCMercury CCD單晶衍射儀,在 298 K下采用經(jīng)石墨單色化的Mo Kα射線(λ=0.071073 nm)作入射輻射,以φ/ω掃描方式在1.98°≤θ≤25.20°范圍內(nèi)收集到 13676個(gè)衍射數(shù)據(jù),其中獨(dú)立衍射點(diǎn)為 4730個(gè) (Rint=0.0314),可觀測(cè)的衍射點(diǎn) 3945個(gè) [I＞2σ(I)],見表 1。晶體結(jié)構(gòu)解析采用直接法,由 SHELXL-97程序完成。氫原子坐標(biāo)由理論加氫確定,非氫原子坐標(biāo)通過全矩陣最小二乘法進(jìn)行各項(xiàng)異性溫度因子修正,最終得到了化合物 6分子的立體結(jié)構(gòu),見圖 3。經(jīng)檢索該晶體結(jié)構(gòu)為首次報(bào)道。

圖3 化合物 6的分子結(jié)構(gòu)Fig.3 Molecular structure of compound 6

表1 化合物 6的晶體學(xué)數(shù)據(jù)Table 1 Crystal structure parameters of compound 6

致謝:該項(xiàng)目得到華南理工大學(xué)國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃 (項(xiàng)目編號(hào):B15Y9080010)的資助,同時(shí)獲得國(guó)家自然科學(xué)基金 (20671036),廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目 (2007A010500008,2008B010800030)的資助,實(shí)驗(yàn)中各組分對(duì) H IV RT活性的抑制作用由南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院抗病毒研究中心李潤(rùn)明博士測(cè)定,特此致謝!

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Roots of Lantana camara:Chemical Constituents and HIV-1 Reverse Transcriptase Inhibitory Activity

HE Jun-jie,ZHENGLian-fu,HUO Tian-wu,WANG Ting-ting,ZENG He-ping＊
School of Chemistry and Chem ical Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China

R248.2;Q946.91

A

1001-6880(2011)01-0025-05

2010-01-11 接受日期:2010-04-20

華南理工大學(xué)國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃 (項(xiàng)目編號(hào):B15Y9080010)的資助,同時(shí)獲得國(guó)家自然科學(xué)基金(20671036),廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目。

＊通訊作者 Tel:86-532-88963253;E-mail:zenghp@scnu.edu.cnv