袁 琳，白永生，周明眉，胡 娜，陸 雄

(上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實驗中心，上海 201203)

2型糖尿病大鼠的尿液代謝組學(xué)改變

袁 琳，白永生，周明眉，胡 娜，陸 雄

(上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實驗中心，上海 201203)

目的 通過檢測2型糖尿病大鼠尿液代謝譜的變化，探討代謝組學(xué)在糖尿病研究中的應(yīng)用。方法SD大鼠高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周后，腹腔注射鏈脲菌素(Streptozotocin，STZ)37 mg/kg建立2型糖尿病模型，動態(tài)檢測空腹血糖(FBG)變化，檢測甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)及胰島素(INS)水平。分別于造模前、造模后1、2、4、6、8周收集大鼠尿液，采用氯甲酸乙酯(ECF)衍生和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)的方法檢測大鼠尿液代謝譜的變化。結(jié)果 造模后大鼠FBG持續(xù)升高，F(xiàn)FA、TG、TC明顯升高，血清INS含量明顯降低;造模后，模型組大鼠代謝譜與對照組完全區(qū)分，并隨時間變化逐漸偏離;比較兩組差異，從差異變量中鑒定出10個生物學(xué)標記物。結(jié)論 高糖高脂喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量STZ造模2型糖尿病大鼠尿液代謝組學(xué)發(fā)生明顯變化，尿液代謝組學(xué)在一定程度上反映2型糖尿病大鼠的病理變化。

2型糖尿病;大鼠;高糖高脂喂養(yǎng);鏈脲菌素;代謝組學(xué)

本研究通過尿液為基礎(chǔ)的代謝組學(xué)分析方法，研究高糖高脂飼料聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的大鼠糖尿病模型不同階段尿液代謝譜的變化，探索代謝組學(xué)在糖尿病研究中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Sprague Dawley雄性大鼠17只，4周齡，體重80～90 g，來源于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司【SCXK(滬)2003-0002】，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級動物實驗室，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 試劑與儀器

鏈脲佐菌素，Sigma公司，批號：015K1279;胰島素放射免疫分析藥盒，上海放射免疫分析技術(shù)研究有限公司，批號：20071030;全自動生化分析儀測定所用甘油三酯與總膽固醇試劑盒，上海豐匯醫(yī)學(xué)科技有限公司，批號分別為050338，050627;游離脂肪酸(NEFA)測試盒，南京建成生物工程研究所，批號：20080527;L-2-氯苯丙氨酸，上海瀛正科技有限公司，批號：060507;氯甲酸乙酯，批號：110713-2006009; 氯仿，批號：041007; 吡啶，批號：L0509201，均購自上海潤潔化學(xué)試劑有限公司。放射免疫計數(shù)器，型號：SN-682γ，中國科學(xué)院上海原子能研究所生產(chǎn);全自動生化分析儀，型號：日立7080;氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent 6890N氣相色譜儀和5975B質(zhì)譜儀，美國安捷倫(Agilent)科技公司;新型大鼠代謝籠，蘇州市馮氏實驗動物設(shè)備有限公司。

1.3 造模方法

SD雄性大鼠隨機分為正常對照組7只與糖尿病模型組10只。對照組大鼠普通飼料喂養(yǎng)，模型組大鼠以高糖高脂飼料(為普通飼料基礎(chǔ)上添加10%豬油、10%蛋黃粉和20%蔗糖)喂養(yǎng)。喂養(yǎng)6周后，模型組按37 mg/kg的劑量腹腔注射2%STZ溶液(臨用前用0.l mol/L，pH 4.4的檸檬酸緩沖液)，對照組注射等劑量的檸檬酸緩沖液作為對照。一周后檢測造模組大鼠FBG≥7.0 mmol/L為糖尿病成模大鼠，成模7只。

1.4 生化指標檢測

分別于造模后 1、2、4、6、8 周末，大鼠禁食 12 h后尾靜脈取血檢測FBG。8周末腹主動脈取血，酶學(xué)方法檢測 TG、TC;銅離子結(jié)合法檢測 FFA，放免法檢測INS，均按照試劑盒說明書操作。

1.5 尿液標本收集處理

分別于造模后 1、2、4、6、8 周末，代謝籠收集大鼠尿液，-70℃冰箱保存。

尿液代謝譜測定方法：取尿液1.5 mL，12 000 r/min離心10 min后，取上清液300 μL，依次加入蒸餾水300 μL、內(nèi)標物(0.1 mg/mL氯苯丙氨酸)100 μL、無水乙醇 400 μL、吡啶 100 μL、氯甲酸乙酯(ECF)50 μL，振蕩 10 s，超聲 1 min;加入氯仿 300 μL，振蕩30 s后，3000 r/min離心 5 min;加入 100 μL 7 mol/L的 NaOH 溶液，同時加入 ECF 50 μL，振蕩10 s，超聲1 min;振蕩30 s后，3000 r/min離心10 min。吸去上清液，氯仿層加入少量無水硫酸鈉，干燥后，進入氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS)，用 DB-5MS色譜柱進行分離。①色譜條件：色譜柱 DB-5MS毛細管柱(5%diphenyl cross-linked 95%dimethylpolysiloxane ：30 m × 250 μm i.d.，0.25 μm;Agilent J＆W Scientific，F(xiàn)olsom，CA);不分流進樣。進樣量1 μL。進樣口溫度 280℃;離子源溫度 200℃;接口溫度260℃。程序升溫起始溫度 80℃;保持2 min，以 10℃ /min升至 140℃，以 4℃ /min 升至240℃，再以 10℃ /min升至 280℃，保持 3 min。載氣為氦氣，載氣流速 1 mL/min。②質(zhì)譜條件：溶劑延時5 min;電離方式EI;電子能量70 eV;質(zhì)譜掃描范圍：m/z 30-550;全掃描方式。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

生化數(shù)據(jù)以(ˉx±s)表示。使用計算機軟件SSPS13.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間均數(shù)比較用t檢驗，P＜0.05表示差異具有顯著性。

代謝組學(xué)數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理：原始 GC/MS數(shù)據(jù)文件，色譜峰經(jīng)XCMS軟件進行峰提取，去除內(nèi)標峰和柱流失峰后，以 Excel文件貯存，導(dǎo)入到 SIMCA-P 11.0軟件包(Umetrics，Ume?，Sweden)，采用主成分分析(principal component analysis，PCA)和最小方差判別分析法(partial least square-discriminant analysis，PLS-DA)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病大鼠生化指標

造模后1周內(nèi)，模型組 FBG明顯升高，在之后的8周動態(tài)觀察中FBG基本穩(wěn)定，與對照組比較差異均有顯著性(P＜0.01)(表1)。造模8周末，模型組大鼠FFA、TG、TC的明顯升高，血清胰島素含量明顯降低，與對照組比較差異均有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)(表2)。

表1 FBG動態(tài)變化(s，n=7，mmol/L)Tab.1 Comparison of fasting blood glucose

表1 FBG動態(tài)變化(s，n=7，mmol/L)Tab.1 Comparison of fasting blood glucose

注：**與正常組比較 P＜0.01。Note：compared with the control group，**P＜0.01.

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表2 FFA、TG、TC、INS變化(s，n=7)Tab.2 Comparison of the changes of free fatty acid，triglyceides，total cholesterol and insulin

表2 FFA、TG、TC、INS變化(s，n=7)Tab.2 Comparison of the changes of free fatty acid，triglyceides，total cholesterol and insulin

注：*與對照組比較 P＜0.05，**P＜0.01。Note：compared with the control group，*P＜0.05，**P＜0.01.

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2.2 尿液代謝譜的變化

2.2.1 模型組與對照組代謝模式的比較：氯甲酸乙酯衍生、氣質(zhì)聯(lián)用分析得到的色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過提取和前處理得到的矩陣在SIMCA-P軟件中進行多維統(tǒng)計分析，采用非監(jiān)督的PCA方法，對動物樣本進行分組處理。從結(jié)果看出，造模前、模型組與對照組的代謝譜無差異;造模后1周、4周、8周后，模型組與對照組之間的代謝輪廓有清晰的區(qū)分，說明糖尿病大鼠成模后兩組間的動物在代謝譜上差異有著顯著性 (圖1 A-D，彩插5)。

為了更加直觀地將正常大鼠在喂養(yǎng)過程以及模型大鼠在成模后代謝模式的變化呈現(xiàn)，本實驗將對照組和模型組大鼠尿樣的代謝組數(shù)據(jù)進行多維統(tǒng)計的分析。結(jié)果表明，對照組動物在喂養(yǎng)的過程中，隨著時間的推移，除了第4周的樣本與其他幾周的樣本有些分離趨勢，其他幾周的樣本間沒有明顯的分離(圖2，彩插5)。糖尿病模型大鼠代謝模式則呈現(xiàn)規(guī)律性變化，隨時間不斷向左推移(圖3，彩插5)。

2.2.2 樣本的PLS-DA分析：非監(jiān)督的多維統(tǒng)計方法(如上面用到的PCA)可以反應(yīng)不同動物代謝物之間的總體差異，但這種差異是一種廣泛性的差異，包括各種因素的影響。為了更好的反應(yīng)糖尿病病理狀態(tài)下產(chǎn)生的差異，試驗中采用了偏最小方差―判別分析(PLS-DA分析)。通過這種監(jiān)督的方法建立的模型，可以找到對模型影響較大的代謝物變量，而這些代謝物是與高糖高脂飼料喂養(yǎng)和STZ損害有著密切的關(guān)系，有利于對高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型發(fā)生機制做深入的理解。

本實驗選擇了病理變化程度最大的第8周的樣品進行PLS-DA的代謝模式比較。對照組大鼠與模型組大鼠尿液代謝物有著很好的區(qū)分，并且分析59個差異變量，利用NIST譜庫，鑒定了其中10個代謝物 (見表3)。

表3 尿液代謝譜中主要代謝物的變化Tab.3 Changes of main variables in urine metabolic profiles of the rats

3 討論

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后新近發(fā)展起來的一門學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。它通過對生物體液和組織中隨時間改變的代謝物進行檢測、確定、定量和分類，將這些代謝信息與病理生理過程中的生物學(xué)事件關(guān)聯(lián)起來，以監(jiān)測活細胞中的化學(xué)變化。目前代謝組學(xué)已應(yīng)用于包括疾病的診斷、藥物作用機制研究、藥物研發(fā)、分子生理學(xué)、分子病理學(xué)、基因功能組學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、環(huán)境科學(xué)等重要領(lǐng)域［2］。

糖尿病是一種以糖代謝失常為主的內(nèi)分泌代謝性疾病，通常表現(xiàn)為整體的代謝紊亂，因此代謝組學(xué)的方法非常適合于糖尿病的研究。高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合低劑量STZ注射制備的糖尿病大鼠模型是常用的2型糖尿病模型，由于它與人類2型糖尿病有著相似的發(fā)病機制，并且成模率高，模型穩(wěn)定，為研究2型糖尿病提供了良好的基礎(chǔ)［3］。在糖尿病狀態(tài)下，由于血糖升高引起尿糖，帶走大量水分而出現(xiàn)多尿，尿液內(nèi)小分子代謝物的含量卻相對較少。這就給采用尿液做樣本，通過代謝組學(xué)方法研究糖尿病造成一定的困難。GC/MS是目前較常用的代謝組學(xué)研究方法，與其他代謝組學(xué)方法，如核磁共振技術(shù)(NMR)、液相色譜/質(zhì)譜(LC/MS)方法比較，它的優(yōu)勢在于具有較高的分辨率和檢測靈敏度，并且有可供參考的標準譜圖庫，可以方便地得到待分析代謝組分的定性結(jié)果，其局限性表現(xiàn)為GC只能對樣品中的揮發(fā)性組分實現(xiàn)直接分析，而得不到體系中難揮發(fā)的大多數(shù)代謝組分的信息［4］，如果能將這類物質(zhì)進行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)處理轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的揮發(fā)性衍生物，就可以擴大氣相色譜的測定范圍。因此，揮發(fā)性化學(xué)衍生物的形成在氣相色譜中具有重要的應(yīng)用價值。ECF作為胺的酰基化試劑，衍生產(chǎn)物色譜性能優(yōu)良。本研究采用ECF的衍生和GC/MS為基礎(chǔ)的代謝組學(xué)方法研究高糖高脂飼料聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的大鼠糖尿病模型尿液代謝譜的變化，取得了良好的分離效果。

從實驗結(jié)果來看，造模前模型組與對照組的代謝譜無差異;造模1周后，模型組與對照組之間的代謝輪廓有清晰的區(qū)分，說明大鼠正常生理代謝被明顯干擾。在隨后的幾周中，雖然模型組FBG水平基本保持穩(wěn)定，但是其代謝圖譜隨著時間的變化不斷偏離，表明尿液的代謝譜中包含更多糖尿病病理變化信息。為了確定高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠相關(guān)的代謝物，選取實驗?zāi)悠愤M行PLS-DA的代謝模式比較，找出了差異變量，并利用NIST譜庫，鑒定了10個代謝物，其中一些三羧酸循環(huán)的代謝產(chǎn)物如琥珀酸、檸檬酸鹽等都有降低，同時一些氨基酸物質(zhì)包括亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸和一些有機酸(如丙酸、醋酸)的表達水平在模型組中都有上升。這與糖尿病病理狀況相符，胰島素不足時，一些酶活性減弱，使三羧酸循環(huán)減弱;同時蛋白質(zhì)代謝紊亂，肌肉及肝中蛋白質(zhì)合成減少而分解增多，血漿及尿液中氨基酸增多。另外，本實驗還檢測到一些含有苯環(huán)的化合物，例如對羥基苯乙酸、馬尿酸水平降低。這些含苯基的化合物主要是由腸道內(nèi)的菌群代謝產(chǎn)生，代謝的母體主要是食物中的多酚和食物蛋白分解出來的一些芳香族的氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸等［5，6］，表明糖尿病大鼠的腸道內(nèi)的菌群代謝發(fā)生紊亂。對這些內(nèi)源性化合物代謝通路的進一步分析，對于深入研究糖尿病病因及發(fā)病機制有著極其重要的意義。

(本文圖1～3見彩插5。)

［1］ Lindon JC，Holmes E，Nicholson JK.So what’s the deal with the metabonomics? ［J］.Anal Chem，2003，75(17)：384A-391A.

［2］ Lindon J C，Holmes E，Nicholoson J K，et a1.Metabonomics technologies and their applications in physiological monitoring，drug safety assessment and disease diagnosis［J］.Biomarkers，2004，9：1-31.

［3］ 何清華，周迎生，王征，等.2型糖尿病大鼠模型制備的影響因素及其特點［J］.中國實驗動物學(xué)報，2007，12，15(6)：425-429.

［4］ 任洪燦，王廣基，阿基業(yè)，等.代謝組學(xué)分析技術(shù)平臺和數(shù)據(jù)處理的新進展［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2007，12(12)：1332-1338.

［5］ Nowak A，Libudzisz Z.Influence of phenol，p-cresol and indole on growth and survival of intestinal lactic acid bacteria［J］.Anaerobe，2006，12(2)：80-84.

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Urinary metabonomic variation in type 2 diabetic rats

YUAN Lin，BAI Yong-sheng，ZHOU Ming-mei，HU Na，LU Xiong
(Experiment Center of Science and Technology，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China)

Objective To investigate the urinary metabonomic variation in diabetic rats in order to explore the application of metabonomics in research of diabetes.Methods Male Sprague-Dawley rats were fed with high-fat and high-sucrose diet for 6 weeks and then injected with vehicle or streptozotocin(STZ)in a dose of 37 mg/kg.Fasting blood glucose(FBG)was monitored weekly after STZ injection.Urines of normal rats and model rats were collected at 1，2，4，6，8 weeks after STZ injection.Serum insulin(INS)，triglyceride(TG)，total cholesterol(TC)and free fatty acids(FFA)were measured at 8 weeks after STZ injection and the rats were sacrificed.The metabolic profiles were analyzed using ethyl chloroformate(ECF)derivatization and gas chromatography-mass spectrometry(GC/MS).Results Compared with the control rats，the FBG，TG，F(xiàn)FA were significantly higher while the INS was reduced in the model rats.The metabolism profiles of the model rats were significantly different from that of the control rats，and changed with time.Comparative study was applied and ten biological markers were different between the normal and model rats.Conclusions Significant changes in urine metabonomics occurre in type 2 diabetic rats induced by high-fat and high-sucrose diet and low dose of STZ，and it may reflect to a certain extent the pathological changes of type 2 diabetic rats.

Type 2 diabetes;Rat;high-fat，High-sucrose diet;Streptozotocin;Metabonomics

Q95-33，R-33

A

1005-4847(2011)02-0111-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.006

糖尿病是以長期高血糖為主要特征，同時伴有脂肪、蛋白質(zhì)、水、電解質(zhì)等代謝障礙的內(nèi)分泌代謝性疾病。作為一種“綜合征”，糖尿病很難用單一的評價指標和發(fā)病機制來反應(yīng)其發(fā)生及變化。代謝組學(xué)(metabonomics)是研究機體代謝產(chǎn)物譜變化的一種新的系統(tǒng)方法，它借助高通量、高靈敏度與高精確度的現(xiàn)代分析技術(shù)，分析生物樣本如尿液中內(nèi)源性代謝物整體組成，通過其復(fù)雜的、動態(tài)的變化來辨識和解析被研究對象的生理病理狀態(tài)，反映機體在內(nèi)外因素的影響下整體代謝的變化規(guī)律［1］，因此，代謝組學(xué)對于闡明生命復(fù)雜系統(tǒng)具有極為重要的意義。

上海市重點學(xué)科建設(shè)項目(編號：T0301);上海高校選拔培養(yǎng)優(yōu)秀青年教師科研專項基金(編號：szy08043)。

袁琳(1980-)，女，研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病研究。E-mail：yl-shutcm@163.com

陸雄。E-mail：xionglu93@hotmail.com

2010-10-12