秦曉飛，史海濤，崔興業(yè)，田元龍，王 攀，劉全宏

(陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062)

二氫卟吩e6在艾氏荷瘤小鼠體內(nèi)的分布

秦曉飛，史海濤，崔興業(yè)，田元龍，王 攀，劉全宏

(陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062)

目的 研究二氫卟吩e6(Ce6)在移植瘤小鼠體內(nèi)吸收、分布及代謝的動(dòng)態(tài)變化，以期為聲動(dòng)力療法處理不同部位腫瘤的時(shí)間點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。方法 艾氏移植瘤小鼠尾靜脈注射Ce6后，利用熒光分光光度法和小動(dòng)物活體成像技術(shù)測(cè)定Ce6在小鼠不同組織的富集分布變化規(guī)律。結(jié)果 小鼠尾靜脈給藥后，Ce6迅速分布于全身各組織，在2 h內(nèi)，各組織藥物濃度均達(dá)到峰值，其中以肝含量最高。隨后各組織中藥物濃度均開始下降，以肝中清除速度最快。腫瘤組織中的Ce6含量在注射后不斷上升，2 h時(shí)達(dá)到最高，隨后開始下降，2～10 h代謝比較緩慢，24 h時(shí)濃度降至最低，但仍高于其他組織。結(jié)論 Ce6在艾氏移植瘤中具有腫瘤組織選擇性好、潴留時(shí)間長(zhǎng)并可迅速?gòu)捏w內(nèi)排出等優(yōu)點(diǎn)，有著很好的臨床應(yīng)用前景，同時(shí)提出了不同組織類型不同部位的腫瘤應(yīng)根據(jù)各自適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)進(jìn)行處理。

二氫卟吩e6;艾氏移植瘤;熒光分光光度法;小動(dòng)物活體成像技術(shù)

目前聲動(dòng)力療法中所使用的聲敏劑多為血卟啉(hematoporphyrin derivative，HpD)及其衍生物為代表的第一代光敏劑，它們的組分復(fù)雜，有效成分尚不清楚，使得其穩(wěn)定性和組織選擇性都有一定局限性。以二氫卟吩e6(chlorin e6，Ce6)為代表的第二代光敏劑為單體化合物，它們的組成單一、化學(xué)結(jié)構(gòu)明確、對(duì)腫瘤選擇性較第一代光敏劑有明顯的提高，這些優(yōu)點(diǎn)對(duì)于進(jìn)一步研究聲動(dòng)力療法的機(jī)制，有著更好的臨床應(yīng)用前景［6］。由于 SDT利用了光敏劑能在腫瘤組織中選擇性富集并可長(zhǎng)時(shí)間潴留的這一特性，所以聲敏劑能否在腫瘤組織中具有高度的選擇性富集直接影響著SDT的療效［7］。因此，研究腫瘤組織中Ce6的富集情況，選擇合適的超聲輻照時(shí)間點(diǎn)，是聲動(dòng)力學(xué)療法治療腫瘤的一個(gè)關(guān)鍵前提。

本研究采用熒光分光光度法測(cè)定了 Ce6在荷瘤小鼠各組織中的分布變化，然后進(jìn)一步利用小動(dòng)物活體成像技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)Ce6在腫瘤內(nèi)的富集規(guī)律，從而為SDT治療不同部位腫瘤的時(shí)間點(diǎn)提供基礎(chǔ)參數(shù)。與傳統(tǒng)的光敏劑在組織中的分布研究方法相比［8-9］，小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)可對(duì)同一對(duì)象在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行記錄，避免了由于處死小鼠而帶來的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的誤差，大大地節(jié)省了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，同時(shí)它有著更高的敏感度，所得到的數(shù)據(jù)更加真實(shí)可靠。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用Ce6購(gòu)自杭州電化集團(tuán)有限公司葉綠素廠，用0.01 mol PBS(pH 7.4)避光溶解，使其終濃度為2 mg/mL，過濾滅菌，分裝于 Eppendorf管中，-20℃避光保存。ICR小鼠，雌性，體質(zhì)量18～22 g，來源于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(陜)2007-001】，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。艾氏腹水瘤(Ehrlich ascites tumor，EAT)細(xì)胞系由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供。F-2500熒光分光光度計(jì)為日本 Hitachi公司產(chǎn)品。IVIS 200 small animal imaging system購(gòu)自美國(guó)精諾真公司(Xenogen Corporation)。

1.2 方法

1.2.1 Ce6標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用1%SDS-NaOH從大到小稀釋配制 Ce6 濃度為 1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005 μg/mL的梯度，測(cè)定不同濃度的熒光強(qiáng)度，繪制Ce6的濃度-熒光強(qiáng)度曲線。

1.2.2 移植瘤小鼠不同組織內(nèi)Ce6的分布變化：接種艾氏腹水瘤細(xì)胞于小鼠左腋皮下約1周后，選取體重相差不大，腫瘤大小均一的小鼠50只，隨機(jī)分為10組，每組5只小鼠，在給藥前1天對(duì)小鼠進(jìn)行背部脫毛。尾靜脈注射Ce6 0.25 mL，使其終濃度為 25 mg/kg，避光飼養(yǎng)，分別于給藥后 0.5、1、2、4、6、8、10、12、18、24 h 取材。采用摘眼球取血法取血，放入預(yù)置肝素的離心管，離心后取上清0.2 mL于離心管內(nèi)，再加入1.5 mL SDS-NaOH裂解液，混勻后在37℃裂解24 h。然后斷頸處死小鼠，依次取小鼠背部皮膚、腫瘤、肌肉、肝、腎，用冷的生理鹽水將余血洗凈后，用濾紙吸去多余水分，各稱取0.2 g，加入適量石英砂充分研磨，再加入1.5 mL SDS-NaOH裂解液制成勻漿，將勻漿移至1.5 mL離心管內(nèi)，37℃裂解24 h。隨后離心(3000 r/min，10 min)收集上清，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定各組織樣品的熒光強(qiáng)度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出Ce6的濃度。

1.2.3 Ce6在移植瘤小鼠腫瘤內(nèi)的富集變化：接種艾氏腹水瘤細(xì)胞于小鼠左腋外側(cè)中部皮下約1周后，取體重相差不大，腫瘤大小均一的小鼠3只，分別對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記。在打藥前利用 IVIS 200小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)進(jìn)行成像，作為各自的對(duì)照，各小鼠尾靜脈注射 Ce6 0.25 mL，使其終濃度為25 mg/kg，避光飼養(yǎng)，分別于 10 min 及 0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24 h 對(duì)各小鼠進(jìn)行成像，對(duì)圖像進(jìn)行分析，根據(jù)平均值繪出Ce6在腫瘤內(nèi)的變化曲線。

2 結(jié)果

2.1 Ce6標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，圖1為Ce6濃度-熒光值標(biāo)準(zhǔn)曲線，并做相關(guān)回歸分析，回歸方程：y =126.09x-0.3187(R2=0.9998，P ＜0.05)。

2.2 Ce6在血液和各組織中的分布

圖2和圖3分別表示靜脈注射后Ce6在血液和各組織的分布變化。由圖2可以看出，在尾靜脈注射后，血漿內(nèi)的Ce6濃度在很短的時(shí)間內(nèi)就急速上升并達(dá)到峰值，然后快速下降，隨著被其他組織的吸收和代謝，在12 h后血漿內(nèi)Ce6已降至較低水平并保持穩(wěn)定。由圖3可以看出，Ce6靜脈給藥后0.5 h，肝、皮膚、肌肉各組織就達(dá)濃度高峰，此時(shí)藥物在各組織間的分布以肝最高，其他組織依次為肌肉、皮膚、腎、腫瘤，其中以腫瘤組織分布最低。0.5 h后，肝、皮膚、肌肉各組織開始清除，以肝清除速度最快，并在24 h后達(dá)到最低，肌肉中Ce6含量在4 h后穩(wěn)定在較低水平。腎組織內(nèi)的Ce6含量在給藥后逐漸上升，并于給藥后1h達(dá)到最高，然后迅速下降，4h后與皮膚代謝趨勢(shì)基本一致，均有小幅度升高，之后再緩慢下降，于24 h后達(dá)到最低值。艾氏移植瘤組織內(nèi)的Ce6含量在給藥后逐漸上升，2 h達(dá)到峰值，然后開始下降，2～10 h時(shí)，該組織中的Ce6含量變化不大，清除速度比較緩慢，表現(xiàn)為其對(duì)Ce6的潴留作用，10h后開始迅速下降，并于24h后達(dá)到最低值。

圖1 Ce6標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of the Ce6 concentration

圖2 靜脈注射后Ce6在血液內(nèi)的分布變化Fig.2 Changes of the plasma Ce6 concentration after intravenous injection

2.3 Ce6在腫瘤內(nèi)的分布

為了進(jìn)一步研究Ce6在腫瘤內(nèi)的代謝規(guī)律，實(shí)驗(yàn)采用了小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)對(duì)艾氏移植瘤小鼠進(jìn)行活體成像，圖4(見彩插1)為活體成像結(jié)果，由圖4可以看出，在靜脈注射前，在小鼠全身都觀察不到熒光;靜脈注射后，可以檢測(cè)到小鼠腫瘤局部發(fā)出微弱的熒光，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，腫瘤部位的熒光逐漸增強(qiáng)，在給藥后2 h達(dá)到最亮，隨后就逐漸減弱，在24h降至最低。根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)觀察的腫瘤組織的熒光強(qiáng)度繪制Ce6在腫瘤內(nèi)的富集代謝曲線，從圖5可以看出，給藥后2 h Ce6含量達(dá)到最高，2～11 h一直維持在較高水平，這與熒光光度法測(cè)得的結(jié)果基本一致。

圖3 靜脈注射后Ce6在各組織內(nèi)的分布變化Fig.3 Changes of Ce6 concentration in the organ tissues after intravenous injection

3 討論

Ce6作為一種新型的聲敏劑，它具有化學(xué)組成單一、對(duì)腫瘤組織的選擇性好、聲敏活性強(qiáng)、在正常組織中清除快等優(yōu)點(diǎn)，因此在聲動(dòng)力療法治療腫瘤的研究中具有很好的應(yīng)用前景。根據(jù)SDT殺傷腫瘤的基本原理，Ce6在腫瘤組織內(nèi)的富集變化直接影響著超聲輻照腫瘤時(shí)間點(diǎn)的選擇，實(shí)驗(yàn)前期主要采用熒光分光光度法測(cè)定聲敏劑在各組織中的分布，該方法雖然簡(jiǎn)單易行、穩(wěn)定性高，但是實(shí)驗(yàn)組的個(gè)體差異比較大，而且在稱量、研磨過程中人為因素影響也很大。因此，本實(shí)驗(yàn)在熒光分光光度法的基礎(chǔ)上，采用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)對(duì)小鼠移植瘤中的Ce6進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)跟蹤，大大減少了實(shí)驗(yàn)小鼠的使用數(shù)量、減少了組間差異，同時(shí)，由于數(shù)據(jù)都是來自于同一只小鼠，以自身作為內(nèi)對(duì)照，結(jié)果更加真實(shí)可靠。

圖5 靜脈注射后Ce6在腫瘤內(nèi)的分布Fig.5 The distribution of Ce6 in the tumors after intravenous injection

根據(jù)Ce6在小鼠體內(nèi)的分布和代謝情況可以看出，小鼠靜脈給藥后，Ce6迅速分布于全身各個(gè)組織，給藥后0.5 h，血漿、肝、皮膚、肌肉組織達(dá)濃度峰值，其中以血漿含量最高，其他組織依次為肝、肌肉、皮膚、腎、腫瘤，其中腫瘤組織中的含量最低，所以此時(shí)不宜進(jìn)行超聲處理。0.5 h后，隨著被其他組織的吸收和代謝，血漿中的 Ce6含量迅速下降，而肝、皮膚、肌肉各組織也開始清除，并在24 h后達(dá)到最低值。腎組織中的Ce6含量在給藥后1 h達(dá)到最高值，4 h后與皮膚代謝趨勢(shì)基本一致，提示Ce6可能通過皮膚和腎臟排泄。腫瘤內(nèi)Ce6含量在給藥后2 h達(dá)到最高，2～10 h時(shí)，腫瘤組織中的 Ce6含量變化不大，清除速度比較緩慢，表現(xiàn)為腫瘤對(duì) Ce6的潴留作用，提示Ce6能較好的選擇性富集于艾氏移植瘤組織，而且與其他組織的分布比較大，此時(shí)若對(duì)腫瘤進(jìn)行輻照處理，可有效的殺傷腫瘤細(xì)胞，提示Ce6可作為一理想的聲敏劑應(yīng)用于聲動(dòng)力療法中。同時(shí)，給藥后24 h，各組織中的 Ce6均基本清除完畢，說明Ce6代謝迅速，在體內(nèi)清除速度快，這大大的減少了對(duì)正常組織的毒副作用?；铙w成像的結(jié)果也表明，在給藥后2 h，Ce6在腫瘤內(nèi)的含量達(dá)到最高，在2～11 h，腫瘤內(nèi)的Ce6含量雖緩慢下降，但仍保持在較高濃度，之后開始迅速下降，并于24 h后達(dá)到最低值，該實(shí)驗(yàn)從活體水平靈敏的、高度精確的說明了Ce6在腫瘤內(nèi)的代謝變化規(guī)律，這與熒光分光光度法測(cè)得的結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證實(shí)了數(shù)據(jù)的可靠性。

總結(jié)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)論，可以看出Ce6是一種對(duì)艾氏移植瘤組織選擇性好、在體內(nèi)代謝速率快的理想聲敏劑，在聲動(dòng)力治療腫瘤方面有著很好的臨床應(yīng)用前景。在給藥后2 h，雖然血漿內(nèi)Ce6含量還是很高，但皮膚內(nèi)的血管分布較少，血流量小，此時(shí)可對(duì)淺表腫瘤進(jìn)行超聲處理。此外，不同組織類型不同部位的腫瘤應(yīng)根據(jù)各自適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)進(jìn)行處理。

(本文圖4見彩插1。)

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Chlorin e6 distribution in the Ehrlich ascites tumor-bearing mice

QIN Xiao-fei，SHI Hai-tao，CUI Xing-ye，TIAN Yuan-long，WANG Pan，LIU Quan-hong
(College of Life Sciences，Shaanxi Normal University，Xi′an 710062，China)

Objective To study the absorption，clearance and other pharmacokinetic characteristics of chlorin e6，and to provide a scientific basis for sonodynamic therapy(SDT)of tumors.Methods Erlich ascites tumor(EAT)cells were inoculated into mice，and the tumor-bearing mice

intravenous injection of Ce6 in a dose of 25 mg/kg.The distribution of Chlorin e6(Ce6)in the tumor was observed by in vivo imaging techniques at 0.5，1，2，4，6，8，10，12，18 and 24 h after injection.The mice were killed at 24 h after injection and the drug concenttrations in the tumor and different organ tissues were determined by spectrofluorophotometry.Results After intravenous injection，the Ce6 in the tissues increased to a peak value within two hours，and the highest concentration occurred in the liver.After 2 h the Ce6 level began to decrease with the time course.The concentration of Ce6 in the tumor began to increase after injection and reached the highest level at 2 hours after injection.Then it began to slowly decrease.Its metabolic activity was slow between 2-10 h，showing a retention in the tumor，and reached a minimum at 24 h，but still higher than that in other organs.Conclusions The Ce6 in the EAT tumor-bearing mice has a longer retention and selectivity in the tumor，can be cleared quickly from normal tissues，therefore，is promising for clinical application.According to different metabolic rates in different organs，tumors of different histological types and at different sites should be treated at appropriate time，respectively.

Chlorin e6;Erlich ascites tumor;Spectrofluorophotometry;In vivo imaging;Sonodynamic therapy

Q95-33

A

1005-4847(2011)02-0091-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.001

聲動(dòng)力學(xué)療法(sonodynamic therapy，SDT)是1989年由日本學(xué)者Umemura等首次在國(guó)際超聲會(huì)議上提出的，主要是利用超聲能夠穿透生物組織，激活在腫瘤組織內(nèi)富集并可長(zhǎng)時(shí)間潴留的聲敏劑如血卟啉等而產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞［1，2］。由于該方法對(duì)治療腫瘤有較強(qiáng)的針對(duì)性以及對(duì)正常組織的微創(chuàng)性，所以對(duì)于治療腫瘤，特別是治療組織深層腫瘤有著很好的應(yīng)用前景，該方法自提出以來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者做了大量相關(guān)研究并取得了一定的成果［3-5］。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.10904087，No.81000999);教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(No.20100202110006)。

秦曉飛，(1986-)，男，碩士研究生，從事腫瘤細(xì)胞生物學(xué)研究。Email：qinxiaofei@stu.snnu.edu.cn

王攀，講師，在讀博士，主要從事腫瘤細(xì)胞生物學(xué)及超聲抗腫瘤研究。Email：wangpan@snnu.edu.cn

2010-10-28