黃云，李文莉，龍海燕，肖艷萍，林海*

(1.湖南食品藥品職業(yè)學(xué)院，湖南 長沙 410014；2.湖南省藥品檢驗(yàn)所，湖南 長沙 410001；3.湖南醫(yī)藥工業(yè)研究所，湖南 長沙 410014)

質(zhì) 量

HPLC測定注射用夏天無總堿中比枯枯靈的含量△

黃云1，李文莉2，龍海燕2，肖艷萍3，林海2*

(1.湖南食品藥品職業(yè)學(xué)院，湖南 長沙 410014；2.湖南省藥品檢驗(yàn)所，湖南 長沙 410001；3.湖南醫(yī)藥工業(yè)研究所，湖南 長沙 410014)

目的：建立HPLC測定注射用夏天無總堿中比枯枯靈的含量。方法：采用Polaris C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈-0.1 %三氟醋酸(24∶76)為流動相，檢測波長為225 nm。結(jié)果：比枯枯靈在0.006～0.09 μg與峰面積線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為100.7 %，RSD=2.06 %。結(jié)論：本方法靈敏度高，分離度良好，可用于測定注射用夏天無總堿中比枯枯靈的含量。

高效液相色譜法；注射用夏天無總堿；比枯枯靈

夏天無總堿為從夏天無中提取的有效成分群，總堿中以原阿片堿含量最高，其次為延胡素乙素、巴馬汀、比枯枯靈、紫堇堿、球紫堇堿、罌粟堿等[1,2]。注射用夏天無總堿為夏天無總堿的凍干制劑，具有通絡(luò)、活血、止痛的功效。用于高血壓偏癱、小兒麻痹后遺癥、坐骨神經(jīng)痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、跌打損傷等。藥理毒理實(shí)驗(yàn)預(yù)試表明，比枯枯靈具有顯著的致驚厥作用，且其小鼠靜脈注射LD50為0.9 mg·kg-1，而夏天無總堿小鼠靜脈注射LD50為21.3 mg·kg-1。為保證夏天無總堿臨床使用中的安全性，本文研究建立了注射用夏天無總堿中比枯枯靈的高效液相色譜測定方法，并對10批樣品進(jìn)行了測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters1525+Waters717；色譜工作軟件：Empower；檢測器：Waters2996 PDA檢測器；Mettler AE-240電子天平；超聲波清洗儀 CG-300(300 W，25 kHz)。

1.2 試藥

重蒸餾水；乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。注射用夏天無總堿，規(guī)格：2 mg/瓶(湖南醫(yī)藥工業(yè)研究所，批號：20020210，20020213，20020321，20020329，20020416，20020426，20021020，20021026，20021103，20021112)。比枯枯靈對照品(湖南省藥品檢驗(yàn)所中藥室)，經(jīng)過結(jié)構(gòu)確證，面積歸一化法進(jìn)行純度檢查結(jié)果為99.49 %。陰性樣品自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

VARIAN色譜柱Polaris C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.1 %三氟醋酸(24∶76)；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為225 nm；柱溫為35 ℃。

2.2 檢測波長的選擇

精密稱取比枯枯靈對照品5.00 mg，置10 mL量瓶中，加流動相超聲處理使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得比枯枯靈儲備溶液(0.5 mg·mL-1)；精密量取儲備溶液1 mL置100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液(5 μg·mL-1)。照《中國藥典》(一部)2000年版附錄V A分光光度法試驗(yàn)，以流動相為空白，取對照品溶液在200～500 nm掃描(掃描速度：中速，狹縫：1.0)。結(jié)果比枯枯靈對照品溶液在205.2、225.0 nm波長處有最大吸收；而205.2 nm波長屬末端吸收，故選用225 nm為檢測波長，見圖1。

圖1 比枯枯靈對照品溶液UV圖

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的配制 精密吸取前述比枯枯靈儲備溶液(0.5 mg·mL-1)3 mL，置250 mL量瓶中加流動相至刻度，搖勻，即得(6.0 μg·mL-1)。

2.3.2 供試品溶液的制備 取注射用夏天無總堿(批號：20021128)5瓶的內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置25 mL量瓶內(nèi)，加流動相使溶解并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 陰性樣品溶液的制備 取輔料0.1 g，置25 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

精密吸取上述比枯枯靈對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各5 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果陰性樣品溶液圖譜中，在比枯枯靈保留時(shí)間(約7 min)處無色譜峰出現(xiàn)，表明陰性樣品對比枯枯靈的測定無干擾，見圖2。

A.比枯枯靈對照品 B. 注射用夏天無總堿 C.陰性樣品圖2 注射用夏天無總堿樣品及對照品HPLC圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取比枯枯靈對照品溶液(6.0 μg·mL-1)各1，3，5，7，10，15 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以比枯枯靈峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算，得回歸方程Y=4 637 434.023×C-3 082.29,r=0.999 95。比枯枯靈進(jìn)樣量在0.006～0.09 μg與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液(批號：20021128)，進(jìn)樣6次，每次5 μL，測定，其比枯枯靈峰面積積分值的RSD=1.2 %，結(jié)果表明精密度良好，分離度1.9，理論板數(shù)不低于2 000。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液(批號：20021128)，分別在0，3，6，28，35 h進(jìn)樣1次，測定比枯枯靈峰面積積分值,RSD=1.8 %，表明供試品溶液在35 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(批號：20021128)樣品共5份，按前述供試品方法制備，依法測定，比枯枯靈平均含量為0.085 8 mg·g-1，RSD=0.96 %,表明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量(批號：20021128,含量為0.085 8 mg·g-1)的樣品約0.05 g,共5份，精密稱定,置25 mL量瓶中，加流動相10 mL,振搖使溶解,各分別精密加入比枯枯靈對照品溶液(0.9 mg·mL-1)10 mL，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液5 μL，注入高效液相色譜儀，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.9 樣品測定

按前述方法對10批注射用夏天無總堿中比枯枯靈含量進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表2。

表1 比枯枯靈對照品回收率試驗(yàn)

注：比枯枯靈對照品加入量均為4.32 mg

表2 10批注射用夏天無總堿中比枯枯靈含量測定 mg/支

3 討論

3.1 流動相的選擇

參照有關(guān)文獻(xiàn)[3-5]，配制以下流動相：(1)乙腈-甲醇-0.2 %磷酸(15∶10∶75)，(2)甲醇-醋酸/醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)(75∶25)，(3)甲醇-水-二乙胺-濃氨溶液(50∶50∶0.8∶0.4)，(4)乙腈-0.1 %三氟醋酸(24∶76)。在上述色譜條件下，流動相(1)、(4)均可獲得較理想的高效液相色譜圖，比較流動相(1)、(4)，三氟醋酸黏度比磷酸小，因此采用流動相(4)乙腈-0.1 %三氟醋酸(24∶76)。

3.2 提取方法的考察

本試驗(yàn)根據(jù)不同提取時(shí)間采用回流提取法、超聲提取法、振搖法等多種方法進(jìn)行考察，回流法和超聲法提取含量基本接近，故采用超聲法操作方法簡單。

[1] 國家醫(yī)藥管理局中草藥情報(bào)中心站.植物藥有效成分手冊[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1986：860，1035，130，800，801，153，318，712.

[2] 黃云，肖艷萍，李娟，等.夏天無有效成分的分離和確證[J].湖南中醫(yī)雜志，2005,21(4)：81-82.

[3] 李曉蒙，劉映，廖華衛(wèi).高效液相色譜法測定夏天無中原阿片堿和延胡索乙素的含量[J].中成藥，2002，24(3)：208.

[4] 王棟,寧雅君,伍雪濤,等.用HPLC法測定夏天無制劑中原阿片堿和延胡索乙素的含量[J].藥物分析雜志，1991，11(5)：296.

[5] 顧孝紅，唐平，靳祖英.反相高效液相色譜法測定夏天無中原阿片堿的含量[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2002，13(10)：608-609.

DeterminationofBicucullineinTotalAlkaloidsofCoryadlisAmbailisMigoPowderInjectionbyHPLC

HUANG Yun1，LI Wen-li2，LONG Hai-yan2，XIAO Yan-ping3，Lin Hai2

(1.HunanFoodandDrugVocationalCollege，Changsha410014，China；2.HunanInstituteforDrugControl，Changsha410001，China；3.HunanInstituteofPharmaceuticalIndustryResearch，Changsha410014，China)

Objective： To establish the method for determining the content of Bicuculline in total alkaloids of Coryadlis ambailis migo by HPLC.Methods： Using Polaris C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)as analytical column， with acetonitril-trifluoroacetic acid(24∶76)as mobile phase， detection wavelength at 225 nm.Results： The calibration curve was linear in the range of 0.006～0.09 μg of bicuculline. The average recovery was 100.7 %. and related standard deviation(RSD)was 2.06 %.Conclusion: This method with high sensitivity and resolution can be used to determine the content of bicuculline in total alkaloids of Coryadlis ambailis migo powder injection.

HPLC; Total alkaloids of Coryadlis ambailis migo; Bicuculline

湖南省科技支撐重點(diǎn)項(xiàng)目(2006TP2005)

*林海，Tel：(0731)82275840，E-mail：hailin171@yahoo.com.cn

2010-12-08)