朱 文 佳, 朱 林 敏, 周 鋒 偉, 付 紹 平, 朱 靖 博

( 大連工業(yè)大學(xué) 植物資源化學(xué)與應(yīng)用研究所, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

目前,全球有2.46億糖尿病患者,而中國是繼印度之后的第二大糖尿病國家。餐后高血糖是糖尿病患者的早期癥狀,是加重糖尿病并引發(fā)并發(fā)癥進(jìn)而導(dǎo)致死亡的主要因素[1]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),餐后高血糖是增加心血管疾病死亡的主要因素[2]。α-葡萄糖苷酶抑制劑通過抑制小腸刷狀緣α-葡萄糖苷酶的活性,延緩葡萄糖的生成和吸收,因而可有效降低餐后高血糖[3]。

臨床應(yīng)用的α-葡萄糖苷酶抑制劑多是生物合成或半生物合成藥,種類少、價(jià)格貴、副作用大[4]。藥食兩用植物在我國有著悠久的食用歷史,安全、可靠、有效[5],而且我國擁有得天獨(dú)厚的中醫(yī)食療理論,因此從藥食兩用中藥中篩選出高效、低毒、經(jīng)濟(jì)的α-葡萄糖苷酶抑制劑越來越顯示出其重要性和迫切性。

本研究首次應(yīng)用HPLC對具有糖尿病治療效果的12味藥食兩用中藥進(jìn)行了α-葡萄糖苷酶抑制活性的評價(jià),為了比較全面的評價(jià)藥食兩用中藥的α-葡萄糖苷酶抑制活性,研究選擇5種溶劑對每味中藥進(jìn)行系統(tǒng)提取,然后測定每個(gè)提取部位對α-葡萄糖苷酶的抑制率,為藥食兩用中藥的綜合利用和開發(fā)提供了可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

12種藥食兩用中藥購于河北安國中藥材市場,詳細(xì)藥材信息見表1；對-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷,PNPG,純度99%,Sigma公司；α-葡萄糖苷酶,EC 3.2.1.20,面包酵母,純度≥10 U/mg,Sigma公司；牛血清白蛋白,BSA,純度≥95%,Sigma公司；阿卡波糖,Acarbose,批號AC-0808040,湖南新匯制藥有限公司；其余試劑均為分析純。

HWS 26型電熱恒溫水浴鍋,上海一恒科技有限公司；SK-1型快速混勻器,常州國華儀器有限公司；PNS-3C型pH酸度計(jì),上海鵬順科學(xué)儀器有限公司；UltiMate 3000高效液相色譜分析儀,美國DIONEX公司；微量進(jìn)樣器,寧波市鎮(zhèn)海玻璃儀器廠；1.5 mL離心管,美國Axygen公司；0.45 μm慮膜,上海密粒膜分離技術(shù)有限公司；濾紙,定性濾紙,杭州特種紙業(yè)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 中藥提取物的制備

依次選擇正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、水5種溶劑對12味藥食兩用中藥進(jìn)行系統(tǒng)提取:中藥經(jīng)烘干,粉碎后準(zhǔn)確稱量200 g,按照中藥質(zhì)量與溶劑體積的比為1∶4超聲提取1 h,濾紙過濾,提取溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,浸渣用下一種溶劑繼續(xù)提取。經(jīng)系統(tǒng)提取,中藥所含成分按照極性大小分配到5個(gè)提取部位中,分別是正己烷提取部位(NH)、二氯甲烷提取部位(MC)、乙酸乙酯提取部位(EA)、甲醇提取部位(ME)、水提取部位(AQ)。

1.2.2 反應(yīng)溶液的制備

0.067 mo1/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖液:將7.646 g K2HPO4·3H2O,4.559 g KH2PO4溶解于超純水中,調(diào)整pH至6.8,用超純水定容于500 mL容量瓶中,4 ℃低溫保藏。

0.1 U/mL含0.2% BSA的α-葡萄糖苷酶:稱取0.001 g固體酶,用含0.2% BSA上述磷酸緩沖溶液定容于10 mL容量瓶中,-20 ℃凍存,使用時(shí)低溫解凍并稀釋5倍使用。

8 mmol/L的PNPG:精密稱取0.024 g PNPG,用緩沖溶液定容于10 mL容量瓶中,4 ℃低溫保藏。

0.2 mol/L的Na2CO3終止劑:稱取2.12 g Na2CO3,用超純水溶解,定容于100 mL容量瓶中。

1.2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

依據(jù)傳統(tǒng)的Tremblay[6]法,以PNPG為底物,通過HPLC檢測水解產(chǎn)物4-硝基酚(p-Nitrophenol,PNP)的變化,確定α-葡萄糖苷酶的活性。實(shí)驗(yàn)在1.5 mL離心管中進(jìn)行,反應(yīng)總體積為160 μL:10 μL 0.067 mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液、30 μL 0.1 U/mL α-葡萄糖苷酶,振蕩混勻,37 ℃孵育20 min,加入40 μL 8.0 mmol/L PNPG開啟反應(yīng),震蕩混勻,37 ℃反應(yīng)30 min后,加入80 μL 0.2 mol/L Na2CO3終止反應(yīng),加超純水稀釋至500 μL,振蕩混勻,經(jīng)0.45 μm膜過濾后,用HPLC檢測,通過產(chǎn)物PNP的濃度變化,計(jì)算α-葡萄糖苷酶的活性。

選擇合適的試劑溶解各味中藥的提取部位作為待測樣品，以相同體積的待測樣品代替緩沖溶液加入到反應(yīng)體系中。測試各個(gè)提取部位對α-葡萄糖苷酶的抑制活性,同時(shí)設(shè)置陽性對照(以等體積的Acarbose代替磷酸鹽緩沖溶液)、空白對照(以等體積的磷酸鹽緩沖溶液代替酶液),按照下式計(jì)算抑制率:

式中,A為不加待測樣品時(shí)PNP的濃度(扣除相應(yīng)空白,mmol/L)；B為加入待測樣品后PNP的濃度(扣除相應(yīng)空白,mmol/L)。

1.2.4 PNP的HPLC定量分析

色譜條件:Sino Chrom ODS-BP色譜柱,5 μm,4.6 mm×250 mm,大連依利特分析儀器有限公司；流動(dòng)相:A為乙腈,B為含0.1%甲酸的水溶液,梯度洗脫條件為:0～8 min,20%～30% A；8～13 min,30%～80% A；13～18 min,80%～20% A；18～28 min,20% A；流速,1.0 mL/min；進(jìn)樣量,20 μL；柱溫,常溫；檢測波長,314 nm。

PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線:精確稱取0.020 9 g PNP標(biāo)準(zhǔn)品,用磷酸鹽緩沖溶液超聲溶解,定容于25 mL容量瓶中,配置成6 mmol/L的PNP母液,將母液稀釋成0.002 5、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L。按照上述色譜條件測定,以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.5 樣品溶劑的選擇

向反應(yīng)體系中分別加入5和10 μL的甲醇、二甲基亞砜(DMSO)和丙酮,測定3種溶劑對α-葡萄糖苷酶的抑制效果。

1.2.6 中藥提取物對α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

12味中藥經(jīng)系統(tǒng)溶劑提取共獲得60個(gè)提取部位,水提取部位用水溶解,其他提取部位根據(jù)“1.2.5”的方法,選擇對酶活性影響較小的溶劑溶解。每個(gè)提取部位的初始測定濃度為64 mg/mL(反應(yīng)體系中加入α-葡萄糖苷酶之前的濃度),按照“1.2.3”的方法測定每個(gè)提取部位對α-葡萄糖苷酶的抑制作用,對抑制活性較高的提取部位(抑制率為100%)按照相同的方法,濃度稀釋10倍后進(jìn)一步測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 PNP標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

按照“1.2.4”的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得回歸方程為y=197.4x+0.819 3,R2=0.999 8,說明PNP在0.002 5～0.8 mmol/L線性關(guān)系良好。

2.2 有機(jī)溶劑對α-葡萄糖苷酶活性的影響

甲醇、DMSO、丙酮是α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選中常用的樣品溶媒,在低濃度范圍內(nèi)對酶活性影響較小[7-9]。本研究中,反應(yīng)體系中加入5 μL溶劑時(shí),DMSO對α-葡萄糖苷酶活性有輕微抑制作用,丙酮基本全部抑制了α-葡萄糖苷酶的活性,而甲醇對α-葡萄糖苷酶的活性卻有一定的激活作用；當(dāng)加入體積增加到10 μL時(shí),試劑基本全部抑制了α-葡萄糖苷酶的活性,如表2所示,因此,實(shí)驗(yàn)選擇甲醇、DMSO溶解非水提取部位,同時(shí)設(shè)置甲醇和DMSO的陰性對照(以等體積的甲醇和DMSO代替磷酸鹽緩沖溶液)。

2.3 中藥提取部位對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

陽性藥物Acarbose在64、6.4和0.64 mg/mL時(shí)對α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為76.42%、21.29%、8.73%,相同條件下12種中藥的60個(gè)提取部位對α-葡萄糖苷酶均表現(xiàn)出不同程度的抑制活性,質(zhì)量濃度64 mg/mL時(shí)有31個(gè)組分抑制率達(dá)到100%,占篩選總量的51.6%,將這些組分濃度稀釋到6.4 mg/mL進(jìn)行第2次測定,其中8個(gè)組分抑制活性達(dá)到100%,占篩選總量的13%,將這些組分濃度稀釋到0.64 mg/mL進(jìn)行第3次測定,具體抑制率如表3所示,丁香和肉桂的5個(gè)提取部位都具有較高的抑制活性,枸杞子的5個(gè)提取部位抑制率普遍較低；丁香和肉桂的水提取部位、榧子的甲醇和水提取部位在0.64 mg/mL抑制活性顯著,抑制率均在95%以上。

3 結(jié) 論

本文以PNPG為底物,通過HPLC定量分析水解產(chǎn)物PNP,確定α-葡萄糖苷酶的活性,實(shí)驗(yàn)研究了12味藥食兩用中藥的60個(gè)提取部位對α-葡萄糖苷酶的抑制活性,篩選出了對α-葡萄糖苷酶有顯著抑制效果的8個(gè)活性部位,研究發(fā)現(xiàn),12味中藥的提取物對α-葡萄糖苷酶均有不同程度的抑制效果,丁香和肉桂的每個(gè)活性部位都具有較強(qiáng)的抑制活性。具有抑制活性的提取物中,極性較大組分往往活性較高,有可能是一些糖類或糖類衍生物的競爭性抑制作用；前人研究較少的低極性組分也有一定的抑制活性,一般為黃酮類、生物堿類或萜類化合物[10],這些化合物可能與α-葡萄糖苷酶存在新的作用方式,在抑制類型上可能較多的是非競爭性抑制[11-12],有待進(jìn)一步的研究證實(shí),相關(guān)活性物質(zhì)的進(jìn)一步分離和結(jié)構(gòu)鑒定工作正在進(jìn)行中。

表3 中藥提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率

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