鄭 杰， 吳 海 濤， 朱 蓓 薇,， 董 秀 萍,

( 1.江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013;2.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

抗氧化活性肽是具有抑制生物大分子過氧化或清除體內(nèi)自由基功效的生物活性肽[1]，是被廣泛研究的一類活性肽，尤其是從水產(chǎn)動物中制備天然抗氧化肽替代化學(xué)合成抗氧化劑已經(jīng)越來越引起人們的廣泛關(guān)注。一般認(rèn)為，肽的抗氧化作用與其氨基酸組成、氨基酸序列和空間構(gòu)象有關(guān)[2]。目前，研究學(xué)者已經(jīng)從鰱魚[3]、金槍魚[4]、海灣扇貝[5]和蝦[6]等多種水產(chǎn)動物中制備得到抗氧化活性肽。海參因其蛋白質(zhì)含量極高也成為抗氧化活性肽的良好來源。

水產(chǎn)品抗氧化活性肽的制備方法主要有蛋白酶水解法和微生物發(fā)酵法兩種[7]，也有研究人員通過自溶手段制備得到具有抗氧化活性的魚肉蛋白水解物[8]。海參(Stichopusjaponicus)具有極強(qiáng)的自溶能力，在紫外線照射下可誘導(dǎo)自溶的快速發(fā)生[9]。本研究以海參加工過程中的廢棄物——海參腸為原料，利用紫外線照射誘導(dǎo)其自溶，制備海參腸自溶水解物，并研究其分子質(zhì)量分布、氨基酸組成和體外抗氧化作用，旨在為海參腸的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，并進(jìn)一步豐富海參自溶理論。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

原料：成年鮮活海參，購于大連市長興水產(chǎn)品市場。海參在低溫條件下運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后，立即殺死，取腸清洗后于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH ·,C18H12N5O6)，N-Hippuryl-His-Leu(0.43 ku)和Vitamin B12(1.355 ku)，Sigma公司；Cytochrome C(12.5 ku)，Aprotinin(6.512 ku)，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；18肽(2.342 ku)，西安聯(lián)美生物科技有限公司；所用其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

LG-1.0型真空冷凍干燥機(jī)，沈陽新陽速凍設(shè)備制造有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；UV2100型紫外可見分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司；BIO-RAD 680酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD公司；Z323K型冷凍離心機(jī)，HERMLE，GERMANY；JJ 200Y型精密電子天平，美國雙杰兄弟集團(tuán)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 海參腸自溶水解物的制備

海參腸自溶水解物的制備建立在前期研究工作[10]的基礎(chǔ)上。新鮮海參腸，打漿，紫外線(30 W，0.5 m)照射30 min后，加入3倍體積的McIIvaine’s緩沖溶液(0.2 mol/L，pH 4.4)，于48 ℃自溶4 h，13 500 r/min離心10 min，取上清液，冷凍干燥后即為自溶水解物樣品，于低溫、干燥條件下貯存?zhèn)溆谩＝?jīng)測定，自溶水解物中主要化學(xué)成分為蛋白質(zhì)、糖和脂肪，分別占干物質(zhì)(去除無機(jī)鹽)的63.70 %、14.23 %和2.21%。

1.3.2 分子質(zhì)量分布范圍的測定

海參腸自溶水解物分子質(zhì)量的分布范圍采用依利特P230高效液相色譜(依利特，中國)匹配Superdex Peptide 10/300 GL(10 mm× 300 mm)凝膠過濾柱(通用電器醫(yī)療集團(tuán)，美國)測定。進(jìn)樣量：50 μL；進(jìn)樣質(zhì)量濃度：5 mg/mL；檢測波長：220 nm；流動相：0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.15 mol/L NaCl，pH 7.0)；洗脫流量：0.5 mL/min。分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品分別選用Cytochrome C(12.5 ku)，Aprotinin(6.512 ku)，18肽(2.342 ku)，Vitamin B12(1.355 ku)和N-Hippuryl-His-Leu(0.43 ku)。對凝膠過濾色譜而言，分子質(zhì)量的對數(shù)(y)與保留時間(x)呈線性關(guān)系，經(jīng)過計(jì)算所得分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-0.083 4x+5.755 4(R2=0.994 4)。

1.3.3 氨基酸組成分析

樣品由國家生物醫(yī)學(xué)分析中心采用HPLC法進(jìn)行氨基酸組成分析。

1.3.4 DPPH ·清除能力的測定

按照文獻(xiàn)[11]所述方法，1 mL不同濃度樣品溶液與2 mL磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 6.0)以及2 mL DPPH溶液(200 μmol/L，溶于95%乙醇)混合，漩渦振蕩后，室溫避光保存30 min。在2 000g離心10 min后，取上清液在517 nm下測其吸光值。DPPH ·清除率計(jì)算如下：

(1)

式(1)中，As為樣品吸光值測定值；A0為以95%乙醇代替DPPH溶液時測定的吸光值；A為以去離子水代替樣品時的空白測定值。以VC作為陽性對照。

1.3.5 Fe2+螯合能力的測定

按照文獻(xiàn)[12]所述方法，1 mL不同濃度樣品溶液，與50 μL氯化亞鐵溶液(2 mmol/L)和1 mL去離子水混合均勻后室溫靜置5 min，再加入100 μL菲咯嗪溶液(5 mmol/L)，混勻后室溫靜置5 min，反應(yīng)結(jié)束后，在2 000g條件下離心10 min，取上清液測其在562 nm下吸光值。Fe2+螯合率計(jì)算如下：

(2)

式(2)中，As為樣品測定值；A為用等體積去離子水代替樣品后的測定值。以EDTA-2Na作為陽性對照。

1.3.6 還原能力的測定

按照文獻(xiàn)[13]所述方法，1 mL不同濃度樣品溶液與1 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)以及2 mL鐵氰化鉀溶液(質(zhì)量濃度為10 mg/mL)混合，漩渦振蕩，50 ℃水浴加熱20 min后加入1 mL三氯乙酸溶液(質(zhì)量濃度為100 mg/mL)終止反應(yīng)?；靹蚝?，2 000g離心10 min，取2 mL上清液，并加入2.5 mL去離子水和0.3 mL三氯化鐵溶液(質(zhì)量濃度為1 mg/mL)，室溫靜置10 min后，在700 nm下測定吸光值，吸光值越高則表示還原能力越強(qiáng)，以VC作為陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參腸自溶水解物分子質(zhì)量分布

海參腸自溶后，蛋白質(zhì)發(fā)生顯著降解。采用Superdex Peptide 10/300 GL凝膠過濾色譜柱對海參腸自溶水解物的分子質(zhì)量分布進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。海參腸自溶水解物主要由分子質(zhì)量在3 ku以下的組分組成(質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到87.7%)，而其中又以分子質(zhì)量在1 ku以下的組分為主體。

圖1 海參腸自溶水解物的HPLC譜圖

2.2 海參腸自溶水解物的氨基酸組成

分析海參腸自溶水解物的氨基酸組成，結(jié)果見表1。由表1可知，海參腸自溶水解物含有17種氨基酸，包括除色氨酸之外的所有種類的必需氨基酸。此外，還含有較多與抗氧化活性密切相關(guān)的氨基酸，如Ala、Val和Leu等。海參腸自溶水解物中必需氨基酸占總氨基酸的27.2%。Glu和Gly的含量相對較高。

表1 海參腸自溶水解物的氨基酸組成

2.3 海參腸自溶水解物的抗氧化活性

目前報(bào)道的水產(chǎn)品抗氧化肽中，分子質(zhì)量多低于3 ku，主要集中在1 ku左右，其氨基酸殘基的數(shù)目一般在20個以內(nèi)[7]。氨基酸組成與肽的抗氧化性密切相關(guān)[14]，如富含His、Ala、Val、Met和Leu的肽普遍具有較高的抗氧化活性[15]。從分子質(zhì)量分布范圍和氨基酸組成兩方面來看，海參腸自溶水解物具有潛在的抗氧化活性，因此進(jìn)一步對其抗氧化活性進(jìn)行研究，包括對DPPH ·的清除能力、金屬離子螯合能力以及還原能力。

2.3.1 海參腸自溶水解物對DPPH ·的清除能力

DPPH ·是一種脂溶性的自由基，從抗氧化劑中獲得一個電子后可形成一個穩(wěn)定的分子[16-17]。與大多數(shù)自由基不同的是，它能在室溫條件下保持穩(wěn)定[18]。用分光光度法進(jìn)行定量分析即可評價樣品的抗氧化能力。由圖2可知，海參腸自溶水解物具有一定的DPPH ·清除能力，且清除能力與樣品濃度之間存在明顯的量效關(guān)系，其SC50(DPPH ·清除率達(dá)到50%時的樣品質(zhì)量濃度，S-Scavenging)為4.04 mg/mL，明顯弱于對照VC。海參腸自溶水解物對DPPH ·的清除能力弱于劉程惠等[19]通過胰蛋白酶酶解所制得的1～3 ku的海參肽[IC50為(1.27±0.09)mg/mL]，接近于大馬哈魚魚精蛋白水解物[20]，明顯強(qiáng)于軍曹魚魚皮明膠水解物[21]。

圖2 海參腸自溶水解物對DPPH ·的清除能力

2.3.2 海參腸自溶水解物的Fe2+螯合能力

有機(jī)體內(nèi)的許多氧化反應(yīng)都與金屬離子的轉(zhuǎn)變有關(guān)，金屬離子螯合能力是評價樣品對自由基清除能力的一個重要指標(biāo)。海參腸自溶水解物的Fe2+螯合能力采用菲咯嗪法進(jìn)行測定。菲咯嗪可與Fe2+結(jié)合形成紅色絡(luò)合物，當(dāng)反應(yīng)體系中有金屬離子螯合劑存在時，此絡(luò)合物便會分解，紅色消失。因此，根據(jù)體系顏色的變化即可測定樣品的螯合能力[22]。由圖3可知，海參腸自溶水解物對Fe2+有一定的螯合能力，且其螯合能力的強(qiáng)弱與樣品濃度呈正相關(guān)，其CC50(螯合率達(dá)到50%時的樣品質(zhì)量濃度，C-Chelating)為5.91 mg/mL。海參腸自溶水解物的螯合能力雖然遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于陽性對照EDTA-2Na，但卻接近或強(qiáng)于太平洋鱈魚肉水解物[8]、鰱魚風(fēng)味蛋白酶酶解物[23]及魷魚明膠[24]。

圖3 海參腸自溶水解物的Fe2+螯合能力

2.3.3 海參腸自溶水解物的還原能力

在還原能力測定中，反應(yīng)物在700 nm處的吸光值越大表示還原能力越強(qiáng)。一般情況下，生物活性化合物的還原能力與其抗氧化能力呈正相關(guān)[25-26]，還原能力越強(qiáng)，表明抗氧化能力越強(qiáng)。圖4顯示，海參腸自溶水解物的還原能力均與其濃度呈正相關(guān)，即隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，還原能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為13.20 mg/mL時，反應(yīng)物在700 nm處的吸光值可達(dá)到0.72。將A700為0.5時的樣品濃度定義為AC0.5，結(jié)果顯示，海參腸自溶水解物的AC0.5為8.06 mg/mL，這說明海參腸自溶水解物具有一定的還原能力，遠(yuǎn)強(qiáng)于海蜇蛋白[27]，但明顯弱于對照VC。

3 結(jié) 論

海參腸自溶水解物主要由分子質(zhì)量小于3 ku的組分組成，含有17種氨基酸。海參腸自溶水解物具有一定的DPPH ·清除能力、Fe2+螯合能力和還原能力，其SC50、CC50和AC0.5分別為4.04、5.91和8.06 mg/mL。

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