金 文 剛， 吳 海 濤， 朱 蓓 薇,， 劉 冰， 許 景 光

( 1.西北農林科技大學 食品科學與工程學院, 陜西 楊凌 712100;2.大連工業(yè)大學 食品學院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

扇貝柱產品在生產和加工過程中，會產生大量的低值副產物，占扇貝濕重的70%左右，包括貝殼(52%)、裙邊(9%)、中腸腺(5%)、性腺(卵巢和精巢，3%～9%)[1]。研究表明，扇貝加工副產物中含有大量蛋白質[2]、多糖[3]及脂類[4]等成分，對扇貝加工副產物進行開發(fā)利用，不僅能減少生物資源的浪費，還可避免由此引起的環(huán)境污染。

利用生物酶制備生物活性肽，是當前海產品副產物蛋白質回收利用的有效途徑之一，具有安全性高、條件溫和、易于控制、對設備要求低等優(yōu)點。有關利用扇貝加工副產物中蛋白資源的研究，主要是以扇貝裙邊或內臟團為原料通過外源酶水解，制備調味料[5]或活性肽[6]。扇貝生殖腺是扇貝內臟團的重要組成部分，也是鮮食扇貝的可食用部分，具有較高的安全性，國外對扇貝生殖腺中的酶[7]、脂肪酸[8]和類胡蘿卜素[9]等進行了相關研究，然而，采用外源酶對扇貝生殖腺進行酶解，制備多肽的研究還鮮見報道。為此，本研究分別以雌、雄蝦夷扇貝生殖腺為原料，結合變性預處理，選用中性蛋白酶制備蝦夷扇貝生殖腺多肽，比較雌性和雄性蝦夷扇貝生殖腺的酶解效果及水解液的組成，并對雌性蝦夷扇貝生殖腺水解液中多肽進行了初步分離，考察其還原能力及分子質量分布情況，為蝦夷扇貝生殖腺的高值化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料：鮮活蝦夷扇貝，購于大連長興水產品批發(fā)市場，低溫運至實驗室后，立即從雌性和雄性扇貝內臟團中摘下生殖腺，其中雌性生殖腺呈橘紅色，雄性生殖腺呈乳白色，將其沖洗后分裝，-20 ℃冷凍保藏備用。

主要試劑：中性蛋白酶，南寧龐博生物制藥有限公司；Sephadex G-25葡聚糖凝膠，Pharmacia公司；Cytochrome C(12.5 ku)，Aprotinin(6.512 ku)，上海生工生物工程技術服務有限公司；18肽(2.342 ku)，西安聯美生物科技有限公司；Vitamin B12(1.355 ku)，N-Hippuryl-His-Leu(0.43 ku)，Sigma公司；其余試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

pHS-3C型精密pH計，上海雷磁儀器廠；UV2100型紫外可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；BSE-100型自動部分收集器，上海滬西分析儀器廠；P230p型高效液相色譜，大連依利特分析儀器有限公司；SuperdexTM Peptide 10/300GL凝膠柱，GE Healthcare公司。

1.3 方 法

1.3.1 蝦夷扇貝生殖腺主要化學組成分析

水分的質量分數采用常壓干燥法測定；粗蛋白的質量分數采用微量凱氏定氮法測定；粗脂肪的質量分數采用索氏抽提法測定；總糖的質量分數采用苯酚硫酸法，以葡萄糖為標準品，所得標準曲線為y=0.012 6x-0.018 2(R2=0.992 8)；還原糖的質量分數采用DNS法，以葡萄糖為標準品，所得標準曲線為y=0.001x+0.001(R2=0.999 4)。

1.3.2 酶解方案

1.3.2.1 變性預處理

雌、雄蝦夷扇貝生殖腺分別經勻漿后，加水至底物質量分數達到4%，沸水浴10 min進行變性預處理(變性處理組)，并在加熱過程中保鮮膜封口，防止水分流失，試驗中以未經變性預處理的樣品為對照(未變性處理組)。

1.3.2.2 酶解條件

選用中性蛋白酶(試驗前測定的酶活為64 812 U/g)，以4%蛋白質量分數的生殖腺勻漿為底物，酶加量為3 000 U/g蛋白，pH為7.0，溫度為50 ℃，酶解時間為3 h。

1.3.2.3 酶解工藝

準確稱取雌、雄蝦夷扇貝生殖腺勻漿→分別補水至100 mL(底物質量分數達到4%)→分組(變性處理和未變性處理)→調pH至7.0→加酶→50 ℃恒溫酶解3 h→滅酶(100 ℃，10 min)→離心(4 000 r/min，15 min)→上清液分裝后冷凍保藏。

1.3.3 水解度測定

采用pH-stat法，以滴定所消耗的標準NaOH溶液體積計算水解度。

1.3.4 水解液中可溶蛋白、TCA可溶性寡肽質量濃度和肽得率的測定

將經變性處理和未變性處理的雌、雄蝦夷扇貝生殖腺水解液稀釋一定倍數后，分別測定水解液中可溶蛋白、TCA可溶性寡肽質量濃度以及肽得率?？扇艿鞍踪|量濃度采用考馬斯亮藍 G-250法，以牛血清蛋白為標準，所得標準曲線為y=0.009 9x(R2=0.991 8)；TCA可溶性寡肽的質量濃度以及肽得率采用三氯乙酸(TCA)沉淀結合Folin-酚的方法，分別取水解液2 mL于5 mL離心管中，加入20%的TCA溶液2 mL，靜置20 min，4 000 r/min離心15 min，取1 mL稀釋一定倍數的上清液，采用Folin-酚法測定樣品中可溶性寡肽質量濃度。以牛血清蛋白為標準品，繪制的標準曲線為y=0.003 5x+0.001 28(R2=0.997 7)。根據式(1)計算肽得率：

肽得率=m1/m0

(1)

式中,m1為水解液中TCA可溶性寡肽質量，mg；m0為水解液中總蛋白質量，即水解液中底物蛋白量。

1.3.5 雌性蝦夷扇貝生殖腺水解液Sephadex G-25 凝膠層析分離及還原能力測定

Sephadex G-25凝膠層析柱(1.6 cm×50 cm)，去離子水平衡12 h，雌生殖腺水解液上樣量為0.5 mL，以去離子水為洗脫液，采用部分收集器收集，體積流量為每20 min 5 mL，每次收集40管，分別測定OD280及還原能力。

還原能力測定參照文獻[10]并作修正。取樣品溶液1 mL，依次加入1 mL的磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)，2.0 mL 1%鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]溶液，混勻，在50 ℃下保溫20 min。再加入10%的三氯乙酸溶液1 mL，振蕩混勻后，4 000 r/min離心10 min。取上清液2 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.3 mL 0.1%的三氯化鐵(FeCl3)溶液，靜置10 min，測定OD700，空白組以等體積去離子水代替樣品溶液。

1.3.6 變性處理雌生殖腺水解液的分子質量分布

變性處理雌生殖腺水解液稀釋一定倍數，過0.45 μm微孔膜后，分子質量分布采用依利特P230高效液相色譜結合Superdex Peptide 10/300 GL(10 mm×300 mm)凝膠色譜柱測定。進樣量：50 μL；檢測波長：220 nm；流動相：0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.15 mol/L NaCl，pH 7.0)；洗脫流量：0.5 mL/min。分子質量標準品分別選用Cytochrome C(12. 5 ku)，Aprotinin(6.512 ku)，18肽(2.342 ku)，Vitamin B12(1.355 ku)、N-Hippuryl-His-Leu(0.43 ku)和gly-gly (0.132 ku)。對凝膠過濾色譜而言，分子質量的對數(y)與保留時間(x)呈線性關系，經過計算所得分子質量標準曲線為y=-0.083 4x+5.755 4(R2=0.994 4)。

2 結果與討論

2.1 蝦夷扇貝生殖腺的主要化學組成

經測定，雌、雄蝦夷扇貝生殖腺原料的水分質量分數分別為(82.63±0.05)%和(79.70±0.02)%，生殖腺中粗蛋白、粗脂肪、總糖、還原糖的質量分數見表1。由表1可見，蝦夷扇貝生殖腺的主要成分為蛋白質，與雌生殖腺相比，雄生殖腺的蛋白質量分數相對較大，而雌生殖腺脂肪的質量分數大于雄生殖腺。Palacios等[11]指出雌生殖腺在配子形成期易于富集脂肪，本研究采用的蝦夷扇貝生殖腺在4月份生殖腺指數較高，這可能是雌、雄生殖腺脂肪質量分數差異較大的原因；雌、雄生殖腺中總糖、還原糖的質量分數無顯著差異，Ruiz等[12]發(fā)現不同季節(jié)的生殖腺，蛋白、脂肪和碳水化合物含量存在差異，他們用Bradford法測定的歐洲大扇貝生殖腺中蛋白質量分數在61.2～187.3 mg/g，脂肪和碳水化合物質量分數在6.7～20.6 mg/g和14.1～33.2 mg/g，與本研究測定的蝦夷扇貝生殖腺的化學組成結果基本一致。

表1 蝦夷扇貝生殖腺化學成分的質量分數(4月)

2.2 蝦夷扇貝生殖腺酶解過程中的水解度變化

對蝦夷扇貝生殖腺進行變性預處理，以未變性組為對照，雌、雄蝦夷扇貝生殖腺經中性蛋白酶酶解，水解度隨水解時間變化曲線見圖1。由圖1可見，隨著水解時間的延長，雌、雄生殖腺變性處理組和未變性處理組的水解度在30 min前顯著上升，之后水解度逐漸趨于平緩，至3 h達到平 臺期，雌生殖腺未變性和變性處理組的水解度分別達到25.08%和34.15%；雄生殖腺未變性和變性處理組的水解度分別達到18.37%和28.21%?？梢姡行缘鞍酌杆獯菩陨诚傩Ч麅?yōu)于雄性生殖腺，并且底物經變性處理后，雌、雄生殖腺的水解度分別提高了36.16%和53.57%。究其原因可能是由于蝦夷扇貝生殖腺蛋白質經變性處理后，蛋白質空間結構，即二、三、四級結構被破壞，中性蛋白酶與蛋白質分子內部的酶切位點更容易發(fā)生作用，從而促進了酶解，這與于志鵬等[13]發(fā)現蛋清酶解前熱變性處理得到水解度增大的結果類似。

圖1 蝦夷扇貝生殖腺酶解過程中的水解度曲線

2.3 蝦夷扇貝生殖腺水解液中可溶蛋白、TCA可溶性寡肽質量濃度及肽得率

經測定，雌、雄生殖腺變性處理組和未變性處理組的水解液中，可溶蛋白、TCA可溶性寡肽質量濃度及肽得率結果見表2。由表2可知，與雄生殖腺相比，雌生殖腺水解液中可溶性蛋白質量濃度較低，并且變性處理組的可溶蛋白的質量濃度也低于未變性處理組，而雄生殖腺變性處理和未變性組水解液中，可溶性蛋白的質量濃度差異不大；雌、雄生殖腺變性處理組的水解液，TCA可溶性寡肽質量濃度以及肽得率均高于未變性處理組，其中雌、雄生殖腺變性處理組水解液中，TCA可溶性寡肽質量濃度分別為未變性處理組的2.32和1.05倍，而雌、雄生殖腺變性處理組水解液中，肽得率分別為未變性處理組的1.95和1.27倍。以上結果表明，以雌性蝦夷扇貝生殖腺為底物，利用中性蛋白酶結合變性處理工序，能獲得較高多肽得率的水解液，酶解效果較好。

表2 蝦夷扇貝生殖腺水解液中可溶性蛋白、TCA可溶性寡肽質量濃度及肽得率

2.4 雌性蝦夷扇貝生殖腺水解液的Sephadex G-25凝膠層析分離及還原能力

以中性蛋白酶為外源酶，對雌性蝦夷扇貝生殖腺進行酶解，可獲得較高肽得率的水解液。進一步將雌生殖腺變性處理和未變性處理組的水解液，經Sephadex G-25凝膠層析分離，并監(jiān)測其還原能力，結果見圖2。 由圖2可見，未變性處理的雌生殖腺水解液經Sephadex G-25凝膠層析分離后，獲得4個主要蛋白峰，洗脫液在280 nm的吸光值分別在第10、16、24及30管出現峰值，其中第1、2、4峰都具有一定的還原能力，表明組分可能有一定的抗氧化活性[10]；經變性處理的雌生殖腺水解液經Sephadex G-25凝膠分離后，僅獲得2個主要蛋白組分，洗脫液在280 nm的吸光值分別在第9及16管出現峰值，二者均有一定的還原能力，表明變性處理后雌生殖腺水解液比未變性處理的水解液的分子質量分布更為均一。

圖2 雌性蝦夷扇貝生殖腺水解液的Sephadex G-25凝膠層析分離及還原能力

2.5 經變性處理后雌性蝦夷扇貝生殖腺水解液的分子質量分布

對雌性生殖腺變性處理組水解液的分子質量分布進行考察，結果見圖3。根據保留時間并結合峰面積，對照標準品的分子質量和保留時間，發(fā)現雌生殖腺變性處理組水解液的分子質量分布范圍主要集中于0.25～5 ku，占水解液的74.78%，符合已報道的活性多肽的分子質量范圍。此外，研究還發(fā)現，雄性蝦夷扇貝生殖腺經中性蛋白酶水解后，保水效果較好，在今后的研究中將對其理化性質進行研究。

圖3 雌性蝦夷扇貝生殖腺變性處理組水解液中肽的分子質量分布

3 結 論

蝦夷扇貝生殖腺中粗蛋白的質量分數分別達到干重的(62.89±0.87)%(雌性)和(81.66±0.03)%(雄性)，是制備活性肽的良好來源。利用中性蛋白酶對蝦夷扇貝生殖腺進行酶解，雌性生殖腺水解效果優(yōu)于雄性生殖腺。蝦夷扇貝生殖腺經煮沸變性處理后，可顯著提高水解液的水解度和肽得率。結合變性預處理工序，采用中性蛋白酶對雌性蝦夷扇貝生殖腺進行酶解，可獲得低分子質量的多肽，分子質量分布范圍主要集中于0.25～5 ku，占水解液的74.78%。Sephadex G-25凝膠層析可以對雌性蝦夷扇貝生殖腺水解液進行分離，可獲得具有還原能力的多肽組分。

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