朱 林 敏, 朱 文 佳, 周 鋒 偉, 劉 麗 雙, 付 紹 平, 朱 靖 博

(大連工業(yè)大學(xué) 植物資源化學(xué)與應(yīng)用研究所, 遼寧 大連 116034)

0 引 言

紫杉醇是從太平洋短葉紅豆杉樹(shù)皮中分離到的一種具有抗癌活性的四環(huán)二萜化合物[1]。紫杉醇以其獨(dú)特的抗癌機(jī)理得到廣泛的應(yīng)用,目前已作為乳腺癌、卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌的臨床一線用藥[2]。迄今,紫杉醇主要從紅豆杉屬植物的莖皮中分離獲得,但樹(shù)皮中紫杉醇的含量?jī)H有0.01%左右[3],因此研究高選擇性和穩(wěn)定性好的吸附材料用于紫杉醇的富集分離具有十分重要的意義。分子印跡技術(shù)是模仿天然抗原-抗體反應(yīng)原理,制備對(duì)某一特定分子(模板分子)具有分子識(shí)別性能的分子印跡聚合物的技術(shù)[4]。分子印跡聚合物兼?zhèn)淞松镒R(shí)別體系和化學(xué)識(shí)別體系的優(yōu)點(diǎn),具有選擇性高、制備簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度高、對(duì)環(huán)境耐受性好等特點(diǎn)[5],可選擇性識(shí)別富集復(fù)雜樣品中的目標(biāo)物。因此,MIP被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物活性成分的分離和富集[4,6],但有關(guān)紫杉醇分子印跡聚合物的制備及其吸附特性的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以紫杉醇為模板分子,在優(yōu)化了功能單體和溶劑的基礎(chǔ)上,制備了對(duì)紫杉醇具有高特異性吸附的印跡聚合物,為從植物中富集、分離微量紫杉醇提供了一種新材料。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

UV-2102 PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),HY-4型調(diào)速多用振蕩器,UltiMate3000高效液相色譜儀。

紫杉醇,上海天偉生物制藥有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯,EGDMA,日本TCI公司；偶氮二異丁腈,AIBN,分析純,天津光復(fù)精細(xì)化工研究所,使用前用乙醇重結(jié)晶純化；丙烯酰胺,AM,Amresco公司；α-甲基丙烯酸,MAA,分析純,成都市科龍化工試劑廠,使用前用減壓蒸餾除去阻聚劑；2-乙烯基吡啶,2-VP,Sigma-Aldrich公司；4-乙烯基吡啶,4-VP,Sigma-Aldrich公司。所用其他試劑均為分析純,色譜分析所用試劑均為色譜純。

1.2 紫外光譜分析

選取MAA、AM、2-VP、4-VP 4種功能單體,固定紫杉醇的濃度為0.05 mmol/L,分別加入不同量的功能單體溶液,置于振蕩器振蕩30 min,冰箱中過(guò)夜,以相應(yīng)濃度的功能單體溶液作參比,在200～300 nm掃描紫杉醇-功能單體溶液的紫外吸收光譜。

選取乙腈、氯仿、四氫呋喃3種溶劑,固定紫杉醇乙腈(或氯仿、四氫呋喃)的濃度為0.05 mmol/L,分別加入不同量的2-VP乙腈(或氯仿、四氫呋喃)溶液,置于振蕩器振蕩30 min,冰箱中過(guò)夜,以相應(yīng)濃度的2-VP溶液作參比,在200～300 nm掃描紫杉醇-功能單體溶液的紫外吸收光譜。

1.3 紫杉醇分子印跡聚合物的制備

稱取0.1 mmol紫杉醇,溶于5 mL氯仿中,加入2-VP 0.6 mmol,在振蕩器中振蕩6 h,使紫杉醇與2-VP充分作用,而后加入3.0 mmol EGDMA,10 mg AIBN,充分混合后轉(zhuǎn)入50 mL磨口錐形瓶中,通氮?dú)?0 min,密封,置60 ℃油浴中反應(yīng)24 h,得到塊狀固體。將固體研磨過(guò)75 μm篩后,用甲醇/乙酸(體積比為9∶1)混合溶液索氏提取24 h,除去模板分子后,再用甲醇洗至中性。用丙酮反復(fù)沉降,除去過(guò)細(xì)粒子。晾干后60 ℃真空干燥至恒重,得到紫杉醇印跡聚合物(MIP)。

空白聚合物(non-imprinted polymer,N-MIP)的制備除不加模板分子外,其余與上述制備方法相同。

1.4 聚合物對(duì)模板分子紫杉醇的平衡結(jié)合實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取一組等量MIP和N-MIP 10 mg,分別置于1.5 mL的離心管中,加入0.10～0.40 mmol/L的紫杉醇-氯仿溶液1 mL,于室溫下振蕩18 h。用0.22 μm的濾膜過(guò)濾后,將濾液中的氯仿?lián)]干,加入1 mL甲醇,用HPLC檢測(cè),并計(jì)算出吸附平衡時(shí)溶液中紫杉醇的濃度,根據(jù)結(jié)合前后溶液中紫杉醇濃度變化計(jì)算出聚合物對(duì)紫杉醇的結(jié)合量Q(μmol/g)。

1.5 高效液相色譜分析

色譜柱Hypersil ODS2柱(4.6 mm ×250 mm,5 μm,大連依利特分析儀器有限公司)；流動(dòng)相:體積比為50∶50的乙腈-0.1%甲酸水；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)229 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 功能單體的選擇

模板分子和功能單體在聚合前能否通過(guò)分子間相互作用形成穩(wěn)定的主客體復(fù)合物,是獲得高親和性和選擇性印跡聚合物的關(guān)鍵[7]。因此,選擇合適的功能單體對(duì)制備高識(shí)別性能的分子印跡聚合物是非常重要的。傳統(tǒng)選擇功能單體的方法是先合成印跡聚合物,然后評(píng)價(jià)功能單體對(duì)聚合物的影響,但這種方法耗時(shí)且耗費(fèi)大量的材料。為快速、合理地評(píng)價(jià)在預(yù)聚合過(guò)程中模板分子和功能單體間的相互作用,本文采用紫外分光光度法對(duì)其進(jìn)行了研究。

從紫杉醇與不同功能單體作用的一系列紫外吸收光譜圖(圖1)可以看出:隨著功能單體濃度的增大,紫杉醇的波峰強(qiáng)度逐漸降低,說(shuō)明紫杉醇和4種功能單體均有作用力。加入功能單體后,模板分子的紫外吸收值越小,表明模板分子與功能單體的相互作用越強(qiáng)。比較圖1譜圖發(fā)現(xiàn),4種功能單體中,2-VP與模板分子紫杉醇之間的作用力最強(qiáng),是一種較理想的功能單體。從圖1(c)中可以看出,模板分子與功能單體的比例超過(guò)1∶6時(shí),再增加功能單體的用量,吸收峰的強(qiáng)度變化明顯較弱。由此說(shuō)明,適當(dāng)增加功能單體的用量可使模板分子與功能單體的作用更充分,但并不是功能單體的用量越多越好,因?yàn)檫^(guò)量的功能單體可能導(dǎo)致非組裝的功能單體的殘基產(chǎn)生,從而非選擇性結(jié)合位點(diǎn)增加；也可能引起單體自身的締合,從而導(dǎo)致選擇性結(jié)合位點(diǎn)降低。綜合考慮各因素,本實(shí)驗(yàn)選擇了模板分子紫杉醇與功能單體2-VP的摩爾比為1∶6來(lái)制備印跡聚合物。

Line (a) was obtained against pure solvent,and line (b)～(f) were obtained corresponding functional monomer solution as blanks. The concentration of taxol is 0.05 mmol/L,and the concentrations of functional monomer from lines (a) to (f) are 0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mmol/L,respectively.

圖1 不同功能單體存在下紫杉醇的紫外吸收光譜圖

Fig.1 UV absorption spectra of taxol in the presence of different functional monomers

2.2 紫杉醇與2-VP在不同溶劑中的相互作用

溶劑是合成聚合物的關(guān)鍵因素之一。在聚合過(guò)程中,一方面要求溶劑能夠溶解模板分子和功能單體等物質(zhì),另一方面要求溶劑與模板分子之間的相互作用力較小,不至于影響模板分子與功能單體之間形成主客體復(fù)合物的穩(wěn)定性[8]。本實(shí)驗(yàn)研究了在乙腈、氯仿和四氫呋喃3種溶劑中紫杉醇和2-VP的相互作用。固定紫杉醇的濃度為0.05 mmol/L,加入不同量的2-VP后得到的紫外光譜均顯示:當(dāng)逐漸增加體系中2-VP的濃度時(shí),紫杉醇在乙腈、氯仿和四氫呋喃中吸收峰的吸光度呈下降趨勢(shì),表明紫杉醇和2-VP在不同溶劑中均形成了配合物。紫杉醇(T)和2-VP(M)之間形成配合物可以表示為

(1)

由于反應(yīng)中2-VP的濃度b0遠(yuǎn)大于紫杉醇的濃度a0,參照文獻(xiàn)[9],紫杉醇與2-VP的結(jié)合反應(yīng)公式可推導(dǎo)和整理如下表達(dá)式:

(2)

2.3 聚合物的吸附特性及Scatchard分析

在紫杉醇的濃度為0.10～0.40 mmol/L時(shí),聚合物對(duì)紫杉醇的吸附等溫曲線如圖2所示。在所考察的濃度范圍內(nèi),MIP和N-MIP對(duì)紫杉醇均有吸附；開(kāi)始時(shí)隨著紫杉醇濃度的增大,MIP和N-MIP結(jié)合量都快速增加,當(dāng)濃度達(dá)到0.3 mmol/L時(shí)結(jié)合量均達(dá)到最大值,之后聚合物的吸附趨于飽和,且MIP對(duì)紫杉醇的結(jié)合量明顯高于N-MIP。表明兩種聚合物的空間結(jié)構(gòu)存在差異,印跡過(guò)程中模板分子在MIP中留下的與之空間結(jié)構(gòu)上匹配的具有多重作用點(diǎn)的三維空穴,這種空穴對(duì)模板分子具有高親和性和特異識(shí)別性,所以MIP對(duì)紫杉醇的結(jié)合量大；而在N-MIP中功能基團(tuán)分布是任意的,沒(méi)有形成與模板分子在空間結(jié)構(gòu)上互補(bǔ)的分子識(shí)別位點(diǎn),對(duì)模板分子沒(méi)有特異選擇性,對(duì)紫杉醇的吸附主要是非特異性吸附,其吸附能力較弱,因而N-MIP對(duì)紫杉醇的結(jié)合量小。

表1 紫杉醇與2-VP在不同溶劑中的結(jié)合常數(shù)及摩爾比

圖2 紫杉醇在聚合物上的吸附等溫曲線

分子印跡研究中常用Scatchard模型來(lái)評(píng)價(jià)印跡聚合物的結(jié)合特性[4,9],Scatchard方程為

Q/c=(Qmax-Q)/KD

(3)

式中,KD為結(jié)合位點(diǎn)的平衡離解常數(shù)；Qmax為聚合物對(duì)紫杉醇的最大表觀結(jié)合量；c為平衡時(shí)溶液中紫杉醇的濃度；Q為平衡時(shí)聚合物對(duì)紫杉醇的結(jié)合量。以Q/c對(duì)Q作圖得到一條直線,如圖3所示。

圖3 MIP的Scatchard曲線

說(shuō)明在所研究的濃度范圍內(nèi),MIP中存在一類等價(jià)的結(jié)合位點(diǎn),它對(duì)紫杉醇呈現(xiàn)均勻的親和力。從圖3中直線的斜率和截距分別可以計(jì)算出KD=29.89 mg/L,Qmax=5.66 mg/g。

3 結(jié) 論

以紫杉醇為模板分子,采用本體聚合法首次合成了紫杉醇分子印跡聚合物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該印跡聚合物對(duì)模板分子具有高的結(jié)合量且結(jié)合特異性強(qiáng)?？蓪⑵溆糜诠滔噍腿〖吧V固定相,為紫杉醇的分離純化提供一種新的選擇性富集材料。

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