白璐，李倩，房寧，陳東

（1.北京市疾病預(yù)防控制中心，北京100020；2.北京市大興區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京102600）

固相萃取-氣相色譜法檢測生物檢材中斑蝥素

白璐1，李倩2，房寧2，陳東1

（1.北京市疾病預(yù)防控制中心，北京100020；2.北京市大興區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京102600）

目的建立固相萃取-氣相色譜法檢測生物檢材中斑蝥素的方法。方法采用HLB固相萃取柱提取，氣相色譜-內(nèi)標(biāo)法檢測。結(jié)果斑蝥素在0.1～200mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999以上；精密度（RSD）小于5%。對于添加血樣，方法檢出限為0.05μg/mL，加標(biāo)回收率范圍為93.03%～98.29%。結(jié)論該方法操作簡便、快速、靈敏，提取回收率高，提取物含雜質(zhì)較少，可用于實際案件中全血和尿樣中斑蝥素的檢測。

斑蝥素；固相萃??；氣相色譜法

Abstract：ObjectiveTo develop a solid phase extraction-gas chromatography method for the determination of cantharidin in biological samples.MethodsSamples were purified by using HLB solid phase extraction column and detected by gas chromatography with internal standard added.ResultsThe recovery rate of cantharidin in biological samples ranges from 93.03%to 98.29%，the limit of detection is 0.05μg/mL.The method showed excellent linearity（the linear correlation coefficient is 0.9990）.ConclusionThe method could be applied in forensic toxicological analysis of cantharidin in blood and urine samples with the advantage of simple and quick operation，high recovery rate，good repetition and clean extraction.

Key words：cantharidin；solid phase extraction；gas chromatography

斑蝥素是常見中藥材斑蝥體內(nèi)的一種天然單萜類昆蟲毒素，外用對皮膚有止癢、改善局部神經(jīng)營養(yǎng)及刺激毛根、促進(jìn)毛發(fā)生長的作用，因其毒性較大，中華人民共和國衛(wèi)生部《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》規(guī)定其為育發(fā)類化妝品限用物質(zhì)。斑蝥可與人參、黃芪、刺五加、三棱等藥制成復(fù)方斑蝥膠囊，具有破血消瘀、攻毒療瘡的功效，臨床用于治療原發(fā)性肝癌、肺癌、直腸癌等惡性腫瘤[1]。民間常有輕信謬傳而誤用斑蝥作偏方，用于防治狂犬病、墮胎，治療月經(jīng)不調(diào)、不孕、銀屑病等。斑蝥有大毒，治療劑量和中毒劑量相差不大，用藥稍有不慎即可引起中毒甚至死亡，故斑蝥中毒是法醫(yī)實際工作中常見的檢案。建立準(zhǔn)確、快速、靈敏的方法來檢測生物檢材中斑蝥素，可解決法醫(yī)實際工作中的困難。

目前，國外已有文獻(xiàn)報道采用氣相色譜-質(zhì)聯(lián)用法測定血清中斑蝥素的含量[2]，國內(nèi)有報道采用氣相色譜法測定育發(fā)液、膠囊、口服液和片劑中斑蝥素的含量[1，3-5]，在已有的檢測方法中，樣品的前處理幾乎均是采用了傳統(tǒng)的液-液萃取法[6-7]，試劑消耗量多，對環(huán)境污染和人體健康影響大。為簡化前處理的步驟，減少有機(jī)試劑的使用，本研究采用目前較為常用的固相萃取技術(shù)，建立了固相萃取-氣相色譜法檢測全血和尿液中斑蝥素的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

GC-2010色譜儀，配FID檢測器和GC Solution色譜數(shù)據(jù)工作站（日本島津公司）；微型漩渦混合儀（WH-90A，上海振榮科學(xué)儀器有限公司）；臺式高速離心機(jī)（TGL-20，湖南星科科學(xué)儀器有限公司）；UPW-50N超純水機(jī)（北京歷元電子儀器技貿(mào)公司）；氮吹儀（TTL-DCI）；Whatman GF/A玻璃纖維濾紙；DB-5（30 m×0.32 mm，0.25 μm）色譜柱；Waters Oasis HLB固相萃取柱（6cc，150mg）。

1.2 試劑

斑蝥素對照品（由中國藥品生物制品檢定所提供），內(nèi)標(biāo)正十六烷、甲醇、丙酮（色譜純），鹽酸（分析純）。斑蝥素對照品儲備液（1mg/mL）和內(nèi)標(biāo)溶液（0.1 mg/mL）用丙酮配制，于-20℃冰箱內(nèi)保存。實驗用水為超純水（18.2MΩ·cm）。

1.3 色譜條件

氣體流速：氮氣30 mL/min，氫氣40 mL/min，空氣400mL/min。柱溫180℃，進(jìn)樣口溫度180℃；檢測器溫度200℃。分流比為5∶1。進(jìn)樣量1μL。

1.4 樣品前處理

1.4.1 血液前處理

取2mL血液于50mL錐形瓶中，加20mL 0.1mol/L HCl，于沸水浴中加熱10min，放冷，過濾，濾液用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至3。濾液過HLB固相萃取柱，流速為1～2mL/min，用6mL超純水清洗柱子，真空抽干后用5mL甲醇洗脫。揮干洗脫液，殘渣用0.1mL丙酮定容，漩渦混勻2 min，并以離心半徑6.412cm，10000 r／min離心5min，取上清液，供氣相色譜分析。

1.4.2 尿液前處理

取20mL尿液于燒杯中，滴加0.1mol/L HCl，調(diào)節(jié)pH至3。濾液過HLB固相萃取柱，流速為1～2mL/min，用6mL超純水清洗柱子，真空抽干后用5mL甲醇洗脫。揮干洗脫液，殘渣用0.1mL丙酮定容，漩渦混勻2min，并以離心半徑6.412cm，10 000 r／min離心5 min，取上清液，供氣相色譜分析。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

在選定的實驗條件下，斑蝥素有良好的色譜峰，保留時間為3.838min，與內(nèi)標(biāo)正十六烷和其它雜質(zhì)完全分離（圖1），分離度超過1.5?？瞻籽?、尿提出物在相同的色譜條件下無干擾（圖2～3），內(nèi)源性雜質(zhì)與目標(biāo)物分離良好，該方法具有良好的專屬性。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將斑螯素貯備溶液用丙酮分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.1、1.0、10.0、100.0和200.0 mg/L的系列溶液，將系列溶液分別與等體積的內(nèi)標(biāo)溶液混合均勻，然后準(zhǔn)確吸取1.0μL注入氣相色譜儀，以斑螯素的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，斑蝥素色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)正十六烷色譜峰面積之比（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)線性回歸曲線。線性方程為y=2903x-322，r=0.9998，線性范圍0.1～200mg/L。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)液中斑蝥素和內(nèi)標(biāo)正十六烷色譜圖

圖2 空白血（經(jīng)固相萃?。┑纳V圖

圖3 空白尿（經(jīng)固相萃?。┑纳V圖

2.3 工作曲線及檢出限

向空白血樣中添加斑蝥素對照品溶液，得到質(zhì)量濃度為0.1、1.0、10.0、100.0和200.0 mg/L的系列溶液，充分混勻，按照全血樣品前處理方法進(jìn)行萃取。將前處理液分別與等體積的內(nèi)標(biāo)溶液混合均勻，然后準(zhǔn)確吸取1.0μL注入氣相色譜儀，以斑螯素的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，斑蝥素色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)正十六烷色譜峰面積之比（y）為縱坐標(biāo)，繪制全血樣品中斑蝥素回歸方程為y=2312 x+86.5，線性良好，r=0.9990，線性范圍0.1～200mg/L。

同理，得到尿液中斑蝥素回歸方程為y=2 258 x-174，線性良好，r=0.9992，線性范圍0.1～200mg/L。

以基線3倍噪聲所對應(yīng)的斑蝥素質(zhì)量濃度作為檢出限，以基線10倍噪聲所對應(yīng)的斑蝥素質(zhì)量濃度作為定量限。全血樣品的檢出限為0.05 μg/mL、定量限0.15 μg/mL；尿樣的檢出限為0.005 μg/mL、定量限0.015μg/mL。

2.4 方法準(zhǔn)確度、精密度和加標(biāo)回收率

配制高、中、低三種質(zhì)量濃度（0.75、5.00、20.0mg/L）添加血樣，每個質(zhì)量濃度配制5份，一天內(nèi)早、中、晚測3次，連續(xù)測5d。以工作曲線計算質(zhì)量濃度，求得準(zhǔn)確度和精密度（RSD）。

表1 添加血樣的準(zhǔn)確度和精密度（n=5）

內(nèi)標(biāo)正十六烷精密度：在考察斑蝥素精密度的同時也考察了內(nèi)標(biāo)正十六烷的精密度，結(jié)果日內(nèi)精密度＜1.2%，日間精密度＜2.3%。

配制高、中、低三種質(zhì)量濃度（5.00、20.0、50.0mg/L）添加血樣，每個質(zhì)量濃度配制6份，檢測后以工作曲線計算濃度，求得三種質(zhì)量濃度的加標(biāo)回收率分別為（93.03±3.4）%、（98.29±2.8）%、（94.55±3.7）%，平均回收率為95.29%。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

生物檢材中，斑蝥素含量較低且基質(zhì)成分較為復(fù)雜，給檢測帶來一定困難，通過對DB-1和DB-5兩種不同的色譜柱進(jìn)行比較試驗，結(jié)果顯示用DB-5毛細(xì)管柱（30m×0.25mm，0.25μm）能將斑蝥素與其它基質(zhì)成分有效地分離，可達(dá)到檢測要求。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

同時考察柱溫為160℃、180℃、200℃的分離效果。柱溫160℃，保留時間為4.560min，靈敏度低；柱溫200℃，分析速度快，保留時間為2.891min，但分離效果差；柱溫180℃，分離度超過1.5，峰形良好，保留時間適宜（為3.8min左右）。

3.3 樣品前處理方法

斑蝥素系內(nèi)酸酐結(jié)構(gòu)，當(dāng)溶液酸化后以斑蝥素分子形式存在，能夠被HLB固相萃取柱填料上鍵合的非極性基團(tuán)所富集，因此回收率高；而在堿性水溶液中斑蝥素水解生成斑蝥酸鹽而溶解，不能夠被HLB柱很好的富集，因此回收率較差。

所以樣品pH的變化，對HLB固相萃取柱的富集效果影響很大。本研究采用超純水加標(biāo)實驗，考察了不同pH條件下樣品的富集效果。具體操作方法：取超純水樣4份，每份20mL，分別用鹽酸和氨水調(diào)節(jié)樣品的pH值為3、5、7、9，水樣以大約5mL/min的速度流過HLB萃取柱，水樣過柱后，用真空泵抽去殘留在小柱上的水分，用5.00mL甲醇洗脫吸附在柱上的待測物，氮氣吹干，用0.1mL丙酮定容，上機(jī)測定。測得回收率分別為（98±3）%、（72±2）%、（48±5）%、（21±3）%，pH=3時樣品的回收率最高。

4 結(jié)論

綜上所述，所建立的固相萃取-氣相色譜法可用于檢測全血樣本、尿樣中的斑蝥素，且具有樣品預(yù)處理提取完全、提取物含雜質(zhì)較少、回收率高、重現(xiàn)性好、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點，適用于法醫(yī)實際工作。

[1]劉傳華，陳運久，劉師蓮，等.氣相色譜法測定復(fù)方斑蝥膠囊中斑蝥素含量[J].山東中醫(yī)雜志，2002，21（3）：180-181.

[2]Steyn JM，Hundt HKL.Gas chromatographic-mass Spectrometric method for the quantitation of cantharidin in human serum[J].Chiomatogr Biomed Appl，1988，76：177-179.

[3]趙松華，張衛(wèi)國，付家華.氣相色譜法測定育發(fā)類保健用品中斑蝥素含量[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2002，36（4）：269-270.

[4]曹紅，祝業(yè)，陳玉敏，等.毛細(xì)管氣相色譜法測定抗鼻咽癌口服液中斑蝥素的含量[J].中國新藥雜志，2007，16（4）：309-310.

[5]黃燕萍，張若燕.氣相色譜法測定復(fù)方斑蝥片中斑蝥素的含量[J].中成藥，2008，30（2）：282-283.

[6]李曉飛，陳祥盛，國興明.芫菁科昆蟲體內(nèi)斑蝥素的氣相色譜法測定[J].昆蟲知識，2007，44（3）：459-460.

[7]李英，王成云，楊左軍，等.氣質(zhì)聯(lián)用法測定生發(fā)類化妝品中斑蝥素[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志2001，11（4）：645-646.

（本文編輯：卓先義）

Determination of Cantharidin in Biological Samples by Solid Phase Extraction-Gas Chromatography Method

BAI Lu1，LI Qian2，F(xiàn)ANG Ning2，CHEN Dong1
（1.Beijing Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100020，China；2.Daxing District Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102600，China）

DF794.1

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2011.02.012

1671-2072-（2011）02-0057-03

2010-08-09

證據(jù)科學(xué)教育部重點實驗室開放基金資助項目（09KFKT003）

白璐（1975-），女，主管醫(yī)師，碩士研究生，主要從事毒（藥）物分析研究。E-mail：bailu1975@126.com。