張愛平，劉 丹，韓智勇，劉 詠

1.四川師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610068

2.西南交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031

準(zhǔn)好氧礦化垃圾床處理滲濾液的脫氮菌群研究

張愛平1，劉 丹2，韓智勇2，劉 詠1

1.四川師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610068

2.西南交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031

為探明準(zhǔn)好氧礦化垃圾床處理滲濾液的生物脫氮機(jī)理，采用最大或然數(shù)計(jì)數(shù)法以及一系列的生化試驗(yàn)和鏡檢照片，研究了床層不同高度脫氮菌的數(shù)量和菌群結(jié)構(gòu).結(jié)果表明:床內(nèi)亞硝化菌、硝化菌、厭氧反硝化菌和好氧反硝化菌的平均數(shù)量分別為5.3×106，7.5×106，6.9×103和2.5×105g－1，亞硝化菌、硝化菌和好氧反硝化菌主要富集于反應(yīng)床的表層和底部，厭氧反硝化菌主要富集于反應(yīng)床的中部;從床內(nèi)共分離出3株亞硝化菌，6株硝化菌，5株厭氧反硝化菌和6株好氧反硝化菌.準(zhǔn)好氧礦化垃圾床處理滲濾液的生物脫氮機(jī)理為同步硝化反硝化，主要發(fā)生在反應(yīng)床的表層和底部.

準(zhǔn)好氧礦化垃圾床;滲濾液;亞硝化菌;硝化菌;反硝化菌

Abstract:A biologicalmechanism for nitrogen removal from leachate was investigated using a semi-aerobic aged-refuse bioreactor. The quantity and microbial community structure of denitrifier at various heights of the bioreactor were studied using the most probable number method，a series of biochemical tests and microscopic photos.The results showed that the average quantity of nitrosobacteria，nitrobacteria，anaerobic and aerobic denitrifying bacteria were 5.3×106，7.5×106，6.9×103and 2.5×105per gram，respectively.Nitrosobacteria，nitrobacteria and aerobic denitrifying bacteria were mostly found at the surface and bottom of the bioreactor，while anaerobic denitrifying bacteria were mostly at the middle.Finally，three strains of nitrosobacteria，six strains of nitrobacteria，five strains of anaerobic denitrifying bacteria and six strains of aerobic denitrifying bacteria were isolated from the bioreactor.Thus，the biologicalmechanism could be explained by simultaneous nitrification and denitrification，and its action zones were mainly presented at the surface and bottom of the bioreactor.

Keywords:semi-aerobic aged-refuse bioreactor;leachate;nitrosobacteria;nitrobacteria;denitrifying bacteria

填埋法是近年來應(yīng)用較多的垃圾處理方式，截至2003年底，我國的垃圾填埋處理率接近83%［1］.垃圾在填埋過程中，會(huì)產(chǎn)生對(duì)公眾健康、周圍水源和生態(tài)環(huán)境構(gòu)成極大污染威脅的高濃度滲濾液.滲濾液中的氨氮(NH3-N)有造成水體富營養(yǎng)化、破壞生態(tài)平衡等的危害，亞硝酸鹽氮-N)和硝酸鹽氮(-N)對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物、人體有一定的毒性［2-3］.隨著石化、食品和制藥等工業(yè)的發(fā)展以及人民生活水平的不斷提高，垃圾滲濾液中NH3-N及其他形態(tài)氮化合物的含量急劇增加，因此，如何去除垃圾滲濾液中的氮污染物已備受關(guān)注.

由于填埋垃圾成分的差異，國外所采用的垃圾滲濾液脫氮技術(shù)在國內(nèi)往往難以適用，因此當(dāng)前研究適合我國國情的、有效的垃圾滲濾液脫氮方法顯得尤為迫切.就國內(nèi)垃圾滲濾液的處理現(xiàn)狀而言，仍以常規(guī)的生物法、物化法、土地法等技術(shù)為主，但大多數(shù)技術(shù)存在處理成本高或脫氮效果不穩(wěn)定等缺點(diǎn).利用穩(wěn)定化垃圾處理滲濾液是實(shí)現(xiàn)垃圾可持續(xù)填埋的一項(xiàng)新技術(shù)，具有投資省、操作簡(jiǎn)便、運(yùn)行費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)［4-7］.相關(guān)研究表明:穩(wěn)定化垃圾處理滲濾液效果好，在一定運(yùn)行條件下，CODCr和NH3-N去除率均可穩(wěn)定在92%以上;但對(duì)總氮(TN)處理效果不理想，削減率普遍不足50%［8-10］.

該課題組曾利用穩(wěn)定化垃圾填充準(zhǔn)好氧生物反應(yīng)床，對(duì)垃圾滲濾液進(jìn)行一次過流處理試驗(yàn).結(jié)果表明:生物脫氮效果理想，馴化結(jié)束后 CODCr，NH3-N和TN的去除率分別達(dá)97%，99%和91%以上，不存在-N 和-N 的積累現(xiàn)象［11-14］.為探明其脫氮的生物機(jī)理，對(duì)準(zhǔn)好氧礦化垃圾床處理滲濾液時(shí)的亞硝化菌、硝化菌和反硝化菌的數(shù)量和類別進(jìn)行了研究［15-21］，為優(yōu)化準(zhǔn)好氧礦化垃圾床的設(shè)計(jì)、提高城市衛(wèi)生的管理水平、篩選垃圾滲濾液脫氮優(yōu)勢(shì)菌株、制定固定化微生物產(chǎn)品提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置

試驗(yàn)裝置為由一個(gè)聚氯乙烯管模擬的準(zhǔn)好氧生物反應(yīng)床，其具體結(jié)構(gòu)和尺寸如圖1所示.反應(yīng)床內(nèi)填充埋齡為3年并已趨于穩(wěn)定化的準(zhǔn)好氧垃圾38 kg.

圖1 準(zhǔn)好氧礦化垃圾床結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Sketch of the semi-aerobic aged-refuse bioreactor

1.2 樣品采集

試驗(yàn)樣品取自馴化結(jié)束后正常運(yùn)行的準(zhǔn)好氧礦化垃圾床.在反應(yīng)床的表層、中部和底部(見圖1)分別取樣，共3份樣品.對(duì)于每份樣品，分別取5 g，移入無菌瓶中，瓶內(nèi)裝有含100 mL無菌蒸餾水和30顆玻璃珠，劇烈震蕩30 min后取上層菌液供分析.

1.3 試驗(yàn)步驟

采用選擇性液體培養(yǎng)基，根據(jù)最大或然數(shù)計(jì)數(shù)法對(duì)亞硝化菌、硝化菌、厭氧反硝化菌和好氧反硝化菌進(jìn)行最大可能的計(jì)數(shù).然后，采用選擇性固體培養(yǎng)基，在分離和純化菌株的基礎(chǔ)上，依據(jù)菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)及生理特征、生化特征和美藍(lán)染色的鏡檢照片，查閱文獻(xiàn)［15，17］，對(duì)亞硝化菌、硝化菌、厭氧反硝化菌和好氧反硝化菌的菌株進(jìn)行鑒定.試驗(yàn)期間，通過預(yù)埋電極的方法測(cè)得準(zhǔn)好氧礦化垃圾床表層、中部和底部的氧化還原電位(Eh).

1.4 細(xì)菌計(jì)數(shù)

采用最大或然數(shù)計(jì)數(shù)法測(cè)定試樣菌液中亞硝化菌、硝化菌、厭氧反硝化菌和好氧反硝化菌的數(shù)量，培養(yǎng)條件為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為7～14 d.

亞硝化菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基:1 L蒸餾水加入2 g (NH4)2SO4，0.03 g MgSO4·7H2O，0.25 g NaH2PO4，5 g CaCO3，0.75 g K2HPO4，0.01 g MnSO4·4H2O，調(diào)節(jié)pH為7.2.

硝化菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基:1 L蒸餾水加入 1 g NaNO2，1 g Na2CO3，0.25 g NaH2PO4，1 g CaCO3，0.75 g K2HPO4，0.01 g MnSO4·4H2O，0.03 g MgSO4·7H2O，調(diào)節(jié)pH為7.5.

厭氧反硝化菌的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基:1 L蒸餾水加入5 g檸檬酸鈉，1 g KH2PO4，2 g KNO3，1 g K2HPO4，0.2 g MgSO4·7H2O，液體石蠟10 m L(培養(yǎng)前加入)，調(diào)節(jié)pH為7.2～7.5.

好氧反硝化菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基:1 L蒸餾水加入1 g KNO3，1 g KH2PO4，0.5 g FeCl3·6H2O，0.2 g CaCl2，1 g MgSO4·7H2O，8.5 g琥珀酸鈉，調(diào)節(jié)pH為7.0.

1.5 細(xì)菌分離

通過選擇性培養(yǎng)—挑菌—?jiǎng)澗€分離等步驟對(duì)亞硝化菌、硝化菌、厭氧反硝化菌和好氧反硝化菌進(jìn)行分離，并由此獲得單菌落，經(jīng)反復(fù)純化后，將單菌落接入斜面培養(yǎng)基上以備鑒定之用.

亞硝化菌分離培養(yǎng)基:1 L蒸餾水加入2 g(NH4)2SO4，2 g NaCl，0.4 g FeSO4·7H2O，1 g K2HPO4，0.5 g MgSO4·7H2O，5 g CaCO3，20 g瓊脂粉(提純)，調(diào)節(jié)pH為7.2.

硝化菌分離培養(yǎng)基:1 L蒸餾水加入 1 g NaNO2，2 g Na2CO3，0.5 g MgSO4·7H2O，0.5 g NaCl，0.5 g K2HPO4，0.4 g FeSO4·7H2O，20 g瓊脂粉(提純)，調(diào)節(jié)pH為7.5.

厭氧反硝化菌分離培養(yǎng)基:1 L蒸餾水加入5 g檸檬酸鈉，1 g KH2PO4，2 g KNO3，1 g K2HPO4，0.2 g MgSO4·7H2O，20 g瓊脂粉，液體石蠟10 m L (培養(yǎng)前加入)，調(diào)節(jié)pH為7.2～7.5.

好氧反硝化菌初選培養(yǎng)基:1 L蒸餾水加入1 g KNO3，1 g KH2PO4，0.5 g FeCl3·6H2O，0.2 g CaCl2·7H2O，1 g MgSO4·7H2O，8.5 g琥珀酸鈉，BTB(1%溴百里酚藍(lán)溶于酒精)1 m L，20 g瓊脂粉，調(diào)節(jié)pH為7.0～7.3.

好氧反硝化菌分離培養(yǎng)基:1 L蒸餾水加入0.6 g KNO3，1 g KH2PO4，1 g MgSO4·7H2O，2.4 g琥珀酸鈉，20 g瓊脂粉，調(diào)節(jié)pH為7.0～7.3.

1.6 細(xì)菌的鑒定

采用特殊染色法、平板分離技術(shù)，以及PYG增菌培養(yǎng)與產(chǎn)氣、葡萄糖氧化發(fā)酵、精氨酸雙水解酶、接解酶、氧化酶、脂酶、耐氧與需氧、二乙酰試驗(yàn)(V.P)、耐鹽與耐酸、氨鹽氧化、亞硝酸鹽氧化和硝酸鹽還原等一系列的生化試驗(yàn)，利用雙目生物顯微鏡(XSP－2C，上海光學(xué)儀器廠)和倒置相差顯微鏡(TE2000S，Nikon)對(duì)美藍(lán)染色的菌株進(jìn)行鏡檢，進(jìn)而獲得細(xì)菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)及生理特征、生化特征等.鑒定時(shí)，主要根據(jù)文獻(xiàn)［15，17］確定試驗(yàn)項(xiàng)目，同時(shí)與部分模式菌和文獻(xiàn)［18］所示的標(biāo)準(zhǔn)菌的詳圖進(jìn)行比對(duì)，最終確定待檢菌屬的類別.

2 結(jié)果與分析

2.1 床內(nèi)脫氮菌的計(jì)數(shù)

準(zhǔn)好氧礦化垃圾床在進(jìn)水ρ(CODCr)約為6 000 mg/L，進(jìn)水量為0.5 L，進(jìn)水周期為12 h和運(yùn)行溫度為30℃下，經(jīng) 1個(gè)月馴化后，當(dāng)進(jìn)水ρ(NH3-N)平均值為810 mg/L時(shí)，出水ρ(NH3-N)最低降至8.85 mg/L，NH3-N去除率高達(dá)98.9%，表明滲濾液硝化處理的效果較好;當(dāng)進(jìn)水ρ(TN)為847.73 mg/L時(shí)，出水 ρ(TN)降至 121.71 mg/L，TN去除率約為85.6%，表明該反應(yīng)床對(duì)滲濾液實(shí)現(xiàn)了較好的反硝化處理.此時(shí)床內(nèi)不同填埋高度的亞硝化菌、硝化菌和反硝化菌在培養(yǎng)7～14 d后的數(shù)量如表1所示.

從表1可以看出:①床內(nèi)富集有數(shù)量龐大的亞硝化菌和硝化菌，其平均數(shù)量分別達(dá)到 5.3× 106和7.5×106g－1，與較肥沃土壤的細(xì)菌總數(shù)相近，證實(shí)該反應(yīng)床對(duì)滲濾液進(jìn)行了較好的硝化處理;②床內(nèi)厭氧反硝化菌和好氧反硝化菌的平均數(shù)量分別為6.9×103和 2.5×105g－1，總體上數(shù)量較大，這在一定程度上解釋了反應(yīng)床對(duì)滲濾液較好的TN處理效果;③亞硝化菌、硝化菌、好氧反硝化菌主要富集于準(zhǔn)好氧礦化垃圾床的表層和底部，而厭氧反硝化菌主要富集于反應(yīng)床的中部.這是因?yàn)?，?zhǔn)好氧礦化垃圾床表層通過與空氣接觸自然復(fù)氧，床層中部依靠垃圾表層、導(dǎo)氣管和下部導(dǎo)液管的擴(kuò)散供氧，而床層底部依靠不滿流導(dǎo)液管自然通風(fēng)供氧，三者氧的補(bǔ)給方式導(dǎo)致了氧分壓的差異，進(jìn)而使好氧的脫氮菌呈現(xiàn)出表層和底部富集、厭氧的脫氮菌呈現(xiàn)出中部富集的特征，由此表明準(zhǔn)好氧礦化垃圾床對(duì)滲濾液的生物脫氮作用主要在反應(yīng)床的表層和底部完成.

表1 準(zhǔn)好氧礦化垃圾床內(nèi)脫氮菌的數(shù)量Table 1 Quantity of denitrifier from the semi-aerobic aged-refuse bioreactor

2.2 床內(nèi)亞硝化菌的鑒定

從準(zhǔn)好氧礦化垃圾床的表層、中部和底部各分離到1株共3株亞硝化菌，根據(jù)菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)及生理生化特征、鏡檢照片(見圖2)，鑒定其均為硝化桿菌科的亞硝化球菌屬，詳見表2.

所分離的亞硝化球菌屬是一類常見的亞硝化菌，專性化能自養(yǎng)，它們氧化氨為亞硝酸鹽和固定CO2以滿足能量和碳素的要求;這類細(xì)菌嚴(yán)格好氧，用氧作為最終電子受體.根據(jù)同步硝化反硝化生物脫氮的中間產(chǎn)物理論，這類細(xì)菌在將氧化為的過程中，會(huì)有一定的NO和N2O等氮氧化物氣體逸出，這種現(xiàn)象可以解釋床內(nèi)總氮損失的部分原因.

圖2 亞硝化菌菌株的鏡檢照片(400×)Fig.2 Microscopic photos of nitrosobacteria strains

表2 準(zhǔn)好氧礦化垃圾床內(nèi)亞硝化菌的鑒定結(jié)果Table 2 Determination of nitrosobacteria from the semi-aerobic aged-refuse bioreactor

2.3 床內(nèi)硝化菌的鑒定

從準(zhǔn)好氧礦化垃圾床共分離出6株硝化菌，其中表層、中部和底部各2株.根據(jù)菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、主要生理生化特征和鏡檢照片(見圖3)鑒定可知，分屬硝化桿菌科的硝化桿菌屬和硝化球菌屬，詳見表3.

所分離的硝化桿菌屬是一類常見的硝化菌，專性化能自養(yǎng)，它們將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽并固定CO2以滿足能量和碳素的要求;這類細(xì)菌嚴(yán)格好氧，用氧作為最終電子受體.所分離的硝化球菌屬也是一類常見的硝化菌，專性化能自養(yǎng)，它們氧化亞硝酸鹽成為硝酸鹽和固定CO2以滿足能量和碳素的需要;這類細(xì)菌嚴(yán)格好氧，用氧作為最終電子受體.

圖3 硝化菌菌株的鏡檢照片(400×)Fig.3 Microscopic photos of nitrobacteria strains

表3 準(zhǔn)好氧礦化垃圾床內(nèi)硝化菌鑒定結(jié)果Table 3 Determ ination of nitrobacteria from the semi-aerobic aged-refuse bioreactor

通過在反應(yīng)床內(nèi)預(yù)埋氧化還原電極測(cè)得表層、中部和底部的Eh分別為318，211和235 mV，綜合分析這些亞硝化菌和硝化菌的特征可知，由于這種好氧的環(huán)境有利于生長，從而使它們大量生長并富集，因而提高了反應(yīng)床對(duì)滲濾液硝化處理的能力.

2.4 床內(nèi)反硝化菌的鑒定

根據(jù)培養(yǎng)生長的不同氧環(huán)境，反硝化菌可分為厭氧反硝化菌和好氧反硝化菌兩大類.對(duì)準(zhǔn)好氧礦化垃圾床內(nèi)不同填埋高度的反硝化菌分別在好氧、厭氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，最終分離出5株厭氧反硝化菌和6株好氧反硝化菌.根據(jù)菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、主要生理生化特征和鏡檢照片(見圖4，5)對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表4，5.

圖4 厭氧反硝化菌菌株的鏡檢照片(400×)Fig.4 Microscopic photos of anaerobic denitrifying bacteria strains

由表4，5可以看出:①經(jīng)耐氧性試驗(yàn)測(cè)定，所分離的5株厭氧反硝化菌屬兼氧型生長的菌株有3株，占厭氧反硝化菌總株數(shù)的60%;經(jīng)需氧性試驗(yàn)測(cè)定，所分離的6株好氧反硝化菌屬兼氧型生長的菌株有 5株，約占好氧反硝化菌總株數(shù)的83%.可見，床內(nèi)反硝化菌以兼氧型為主，表明準(zhǔn)好氧礦化垃圾床具同步硝化反硝化反應(yīng)器這一典型的微生物學(xué)特征.②所分離的5株厭氧反硝化菌分別屬于3個(gè)不同的屬，即糞球菌屬、葡萄球菌屬和醋酸桿菌屬;所分離的6株好氧反硝化菌分別屬于6個(gè)不同的屬，即葡萄球菌屬、鄰單胞菌屬、鏈球菌屬、微球菌屬、氣單胞菌屬和假單胞菌屬.

圖5 好氧反硝化菌菌株的鏡檢照片(400×)Fig.5 M icroscopic photos of aerobic denitrifying bacteria strains

表4 準(zhǔn)好氧礦化垃圾床內(nèi)厭氧反硝化菌鑒定結(jié)果Table 4 Determination of anaerobic denitrifying bacteria from the semi-aerobic aged-refuse bioreactor

采用厭氧礦化垃圾床處理滲濾液的相關(guān)研究顯示，反應(yīng)床中細(xì)菌總數(shù)的變化范圍為 0.85× 106～27.5×106g－1［21］.由于準(zhǔn)好氧礦化垃圾床的自然通風(fēng)供氧作用，其處理滲濾液中氮污染物的效果要明顯優(yōu)于厭氧礦化垃圾床，TN去除率提高了30%以上，原因在于準(zhǔn)好氧礦化垃圾床內(nèi)脫氮菌群的數(shù)量更為豐富，其數(shù)量級(jí)接近于厭氧礦化垃圾床內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)，鑒定結(jié)果同時(shí)證實(shí)床內(nèi)存在大量的厭氧反硝化菌和好氧反硝化菌，保證了床內(nèi)硝化反硝化作用的順利進(jìn)行.

反應(yīng)床表層、中部和底部的Eh分別為 318，211和235 mV，均在200 mV以上，填埋的垃圾都處于好氧的宏觀環(huán)境中，這也表明床內(nèi)的自然通風(fēng)供氧效果明顯.厭氧反硝化菌的分離可從同步硝化反硝化的微環(huán)境理論予以解釋，即由于礦化垃圾結(jié)構(gòu)特征、微生物種群構(gòu)成、基質(zhì)分布代謝活動(dòng)、生物化學(xué)反應(yīng)的不均勻性以及物質(zhì)傳遞的變化等因素的相互作用，導(dǎo)致即使在好氧的宏觀條件下，仍可能存在厭氧的微環(huán)境類型.總體上，由于反應(yīng)床的運(yùn)行條件能滿足大部分反硝化菌的生長要求，使它們良好生長并富集，進(jìn)而促進(jìn)好氧反硝化和厭氧反硝化作用尤其是好氧反硝化作用的順利進(jìn)行，最終提高了反應(yīng)床同步硝化反硝化的脫氮能力.

3 結(jié)論

a.通過對(duì)脫氮菌計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，床內(nèi)亞硝化菌、硝化菌、厭氧反硝化菌和好氧反硝化菌的平均數(shù)量分別為5.3×106，7.5×106，6.9×103和2.5×105g－1.其中，亞硝化菌、硝化菌及好氧反硝化菌主要富集于床內(nèi)Eh較大的表層和底部，厭氧反硝化菌主要富集于床內(nèi)Eh相對(duì)較小的中部.

b.脫氮菌的分離和鑒定結(jié)果表明，從床內(nèi)分離到的3株亞硝化菌均為亞硝化球菌屬，6株硝化菌分別屬于硝化桿菌屬和硝化球菌屬2個(gè)屬，5株厭氧反硝化菌分別屬于糞球菌屬、葡萄球菌屬和醋酸桿菌屬3個(gè)屬，6株好氧反硝化菌分別屬于葡萄球菌屬、鄰單胞菌屬、鏈球菌屬、微球菌屬、氣單胞菌屬和假單胞菌屬6個(gè)屬.

c.基于床內(nèi)脫氮菌的菌相分析和床內(nèi)的Eh分析，準(zhǔn)好氧礦化垃圾床處理滲濾液的生物脫氮機(jī)理為同步硝化反硝化，但有關(guān)反應(yīng)床的宏觀環(huán)境中氧的分布與控制，以及與之密切相關(guān)的微環(huán)境的形成過程與結(jié)構(gòu)分析等問題，均有待深入研究.

致謝:感謝四川師范大學(xué)面上項(xiàng)目(10MSL03)的資助.

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Denitrifier Comm unity of Leachate Treated by Sem i-Aerobic Aged-Refuse Bioreactor

ZHANG Ai-ping1，LIU Dan2，HAN Zhi-yong2，LIU Yong1

1.School of Chemistry and Material Science，Sichuan Normal University，Chengdu 610068，China

2.School of Environmental Science and Engineering，Southwest Jiaotong University，Chengdu 610031，China

X703

A

1001－6929(2011)01－0102－08

2010－08－19

2010－10－10

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2010XS36)

張愛平(1979－)，女，浙江金華人，講師，博士，主要研究城市垃圾處理與資源化，zap2002cn@sina.com.