楊利霞，王金勝

（山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山西太谷030801）

西瓜枯萎病又稱萎蔫病或蔓割病，是一種世界性瓜類土傳病害。自1894年Smith在美國南卡羅來納州首次發(fā)現(xiàn)西瓜枯萎病以來，目前該病幾乎發(fā)生于世界各個西瓜產(chǎn)區(qū)，嚴重影響著西瓜的生產(chǎn)[1]?，F(xiàn)在人們主要通過使用化學農(nóng)藥來控制該病害，但化學農(nóng)藥的長期大量不科學的使用，已造成環(huán)境污染、生態(tài)系統(tǒng)破壞等，在這種情況下，人們轉(zhuǎn)向?qū)ふ矣行У闹参镌崔r(nóng)藥。

菊科植物萬壽菊（Tagetes patula），作為觀賞植物在世界上許多國家均有種植。由于萬壽菊花富含可食用黃色素，可用作食品和飼料添加劑[2]，現(xiàn)主要用作提取色素，在我國各地廣泛種植。近年來，該提取物在生物科學研究方面引起了廣泛的關(guān)注。國內(nèi)外對萬壽菊的化學成分如噻吩類、精油、黃酮等的抗線蟲、昆蟲活性有研究報道[3-4]。但對其抗菌性方面的報道[5]很少。

有研究表明，萬壽菊粗提物的抑菌活性，已經(jīng)驗證了萬壽菊根提取物具有廣譜抑菌作用，且對枯萎病菌的抑菌作用效果良好，并能誘導(dǎo)西瓜苗保護酶活性的提高[6-7]；通過不同溶劑提取、層析、色譜等手段對萬壽菊根中抑菌活性成分進行了提取、分離、純化，并對每一級成分進行生物活性追蹤實驗[8]，分離出5類具有抑菌活性的生物堿和提取出7種對枯萎病菌有廣譜抑制作用的黃酮類物質(zhì)[9-10]。但從萬壽菊中提取出的抑菌活性物質(zhì)含量較少，不能以萬壽菊根為原料直接提取抑菌活性物質(zhì)而用于生產(chǎn)。通過對抑菌活性物質(zhì)的化學分析，根據(jù)分析結(jié)果得到這些成分的結(jié)構(gòu)，再用化學方法合成了這些抑菌活性物質(zhì)的類似物，這些物質(zhì)暫時被稱為“萬壽菊殺菌素”，并申請了專利。由于萬壽菊殺菌素難溶于水，為了用于生產(chǎn)，對其進行了配方研究和技術(shù)處理，制成了萬壽菊殺菌素水乳劑[11]。

本試驗的目的是研究萬壽菊殺菌素水乳劑對西瓜枯萎病菌菌絲生長的影響，及其處理西瓜幼苗后誘導(dǎo)西瓜幼苗葉部細胞保護酶活性的變化，以期為開發(fā)新的防治西瓜枯萎病的農(nóng)藥和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)和科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

萬壽菊殺菌素水乳劑，西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum Schlecht.f.sp.niveum），西瓜種子。

1.2 試驗方法

1.2.1 西瓜枯萎病菌粗毒素液及孢子懸浮液的制備 參照蔣細良等[12]的方法。用理查德液體培養(yǎng)基，在25℃、振蕩和3 000 lx光照條件下培養(yǎng)西瓜枯萎病菌，20 d后用雙層紗布過濾，濾液用5 000 r/min離心15 min，收集上清液，即為西瓜枯萎病菌的粗毒素液。

孢子懸浮液的制備：將西瓜枯萎病菌接種在PDA培養(yǎng)基上，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，刮取培養(yǎng)物放到無菌水中，用磁力攪拌器攪拌，過濾后配成每毫升106～107個孢子的懸浮液。

1.2.2 萬壽菊殺菌素水乳劑藥效試驗 菌絲生長抑制率測定[13]：設(shè)4個濃度梯度處理，分別為：Ⅰ.0.1 μg/mL；Ⅱ.0.5 μg/mL；Ⅲ.1.0 μg/mL；Ⅳ.1.5 μg/mL，配制成含不同質(zhì)量濃度萬壽菊殺菌素水乳劑培養(yǎng)基。以不含萬壽菊殺菌素水乳劑為對照。用打孔器從事先培養(yǎng)純化好的菌種中采取菌斑，用接種針轉(zhuǎn)入含藥培養(yǎng)基中。28℃恒溫培養(yǎng)，分別于24，48，72 h后觀察菌斑的生長情況，記錄菌斑生長直徑，然后用十字交叉法測定菌落直徑，計算抑制率，重復(fù)3次，用于選取萬壽菊殺菌素水乳劑抵抗西瓜枯萎病菌的適合質(zhì)量濃度。

相對抑制率=（對照菌斑生長直徑－處理菌斑生長直徑）/對照菌斑生長直徑×100%。

1.2.3 西瓜枯萎病菌粗毒素液及孢子懸浮液與萬壽菊殺菌素水乳劑對西瓜植株的處理 將西瓜種子浸入水中攪拌，漂洗剔除病、劣和雜粒，搓洗掉種子表面的污物，用75%的乙醇消毒，無菌水沖洗干凈，濕紗布包好種子，在20～35℃黑暗下催芽。當種子露白后將被抑制而未發(fā)芽的病、劣種子剔除，將發(fā)芽較好的種子播種，在氣溫20～35℃，最大自然光強75 000 lx的室外條件下用Hogland營養(yǎng)液培養(yǎng)西瓜幼苗。在西瓜成苗期用西瓜枯萎病菌毒素粗提液和孢子懸浮液灌根，對照用等量自來水處理，24 h后植株再噴灑萬壽菊殺菌素水乳劑為處理B，24 h后噴灑等量自來水的為處理A。

1.2.4 生理生化指標測定 噴藥處理24 h后開始測定各處理生理生化指標的變化，然后每隔24 h測定1次，連續(xù)測定1周。

1.2.4.1 SOD酶活性測定方法 采用NBT光還原法[14]。測定樣品在560 nm處的吸光度，以抑制光還原50%為1個酶單位，每個樣品重復(fù)3次。

1.2.4.2 POD酶活性的測定方法 采用愈創(chuàng)木酚法測定[15]。在470nm波長下測定樣品反應(yīng)3 min的吸光度，每個樣品重復(fù)3次。

1.2.4.3 CAT酶活性測定方法 采用紫外吸收法[16]。測定樣品在240 nm波長的吸光度值的變化，以1 min內(nèi)吸光度值降低0.1為1個酶活單位（U），每個樣品重復(fù)3次。

1.2.5 過氧化物同工酶的分離和定位 參照文獻[17]的方法，分離膠濃度為7.5%，濃縮膠濃度為2.5%，電極緩沖液Tris-甘氨酸緩沖液，pH值為8.3，用溴酚藍作前沿指示劑，上樣量為0.02 mL，0～4℃條件下穩(wěn)壓電泳，80 V恒壓電泳0.5 h后改用120 V，用聯(lián)苯胺法染色。相對遷移率：Rf＝x/y（x為固定染色后酶蛋白區(qū)帶的遷移距離，y為固定染色前凝膠的遷移距離）。

2 結(jié)果與分析

2.1 萬壽菊殺菌素水乳劑對西瓜枯萎病菌的抑制情況

在含不同質(zhì)量濃度萬壽菊殺菌素水乳劑培養(yǎng)基上接種直徑相同的菌斑，于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，在培養(yǎng)24，48，72 h后分別用十字交叉法測定菌落直徑，計算相對抑制率（圖1）。

從圖1可以看出，萬壽菊殺菌素水乳劑對西瓜枯萎病菌的生長有抑制作用，當質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL（處理Ⅱ）時，抑制率均達到80%以上。當質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL（處理Ⅲ）時，殺菌素將病菌完全抑制。這種抑制作用持續(xù)時間較長，72 h依然有較高的抑制率。說明萬壽菊殺菌素水乳劑對西瓜枯萎病菌有抑制作用，并隨著質(zhì)量濃度的升高，抑制作用隨之增強。

2.2 萬壽菊殺菌素水乳劑處理西瓜幼苗后葉內(nèi)保護酶活性的變化

2.2.1 SOD酶活性的變化 用萬壽菊殺菌素水乳劑和西瓜枯萎病菌粗毒素液及孢子懸浮液處理西瓜幼苗后，對SOD酶活性進行了測定（圖2）。

圖2表明，西瓜幼苗在西瓜枯萎病菌粗毒素液、孢子懸浮液和萬壽菊殺菌素水乳劑處理后，與對照相比，其SOD酶活性顯著升高，而僅用西瓜枯萎病菌粗毒素液及孢子懸浮液處理的幼苗，其SOD活性則在96 h后降低，144 h后低于對照，說明萬壽菊殺菌素水乳劑可使植物保持較高的SOD酶活性，降低毒素對植物的傷害。

2.2.2 CAT酶活性的變化 萬壽菊殺菌素水乳劑處理后對西瓜CAT酶活性進行測定（圖3）。

圖3表明，在只有西瓜枯萎病菌粗毒素液及孢子懸浮液處理后的西瓜幼苗對外界不良條件作出反應(yīng)，CAT酶活性出現(xiàn)忽高忽低的波動，而加萬壽菊殺菌素水乳劑處理后葉片CAT酶活性先升高后逐漸降低，但仍高于對照。說明萬壽菊殺菌素水乳劑能促使植株調(diào)節(jié)CAT酶活性，使其表現(xiàn)出在高酶活性水平穩(wěn)定的變化。

2.2.3 POD酶活性的變化 用萬壽菊殺菌素水乳劑對西瓜苗進行處理后，測定植物葉片POD酶活性（圖4）。

由圖4可知，植株在感染西瓜枯萎病初期，由于植物的應(yīng)激反應(yīng)其葉片POD酶活性升高，但在120 h后出現(xiàn)降低，而噴灑萬壽菊殺菌素水乳劑后植株P(guān)OD酶活性先升高后又緩慢降低，但一直高于對照，說明萬壽菊殺菌素水乳劑可使植株提高POD酶活性，并穩(wěn)定在一定范圍。

2.3 不同處理后西瓜幼苗體內(nèi)過氧化物同工酶的變化

采用萬壽菊殺菌素水乳劑和西瓜枯萎病菌粗毒素液根處理西瓜幼苗后，120 h測定過氧化物同工酶電泳（圖5）。其中，1～3泳道為對照組，4～6泳道為A處理，7～9泳道為B處理。

從圖5可以看出，感染枯萎病植株（A處理）的酶譜條帶整體染色較輕，說明其酶活性較低，且在 Rf＝0.35 處的譜帶缺失，Rf＝0.52，0.57，0.61處的3條譜帶染色都較輕，而噴灑萬壽菊殺菌素水乳劑植株（B處理）的酶譜條帶數(shù)與對照譜帶條數(shù)一致，且在Rf＝0.52處的譜帶著色明顯加深，說明萬壽菊殺菌素水乳劑可使植株增強該種過氧化物同工酶的活性。

3 結(jié)論與討論

植物中含有很多對植物病原菌有抑制作用的活性物質(zhì)，從植物中尋找殺菌、抑菌活性物質(zhì)是開發(fā)、研制無公害新型殺菌劑的熱點之一[18]。植物源殺菌劑是利用有些植物里含有的某些抗菌物質(zhì)（如大蒜中的大蒜素、蠶豆中的蠶豆酮等）殺死或有效抑制某些病原菌的生長發(fā)育。植物性殺菌劑多為復(fù)合抑菌有效成分，對病原真菌能從多方面加以抑制，從而延緩抗性的產(chǎn)生[19]。本試驗結(jié)果表明，萬壽菊殺菌素水乳劑對西瓜枯萎病菌菌絲生長有明顯的抑制作用，與萬壽菊根提取物有相同的抑菌效果[6]，其中，當質(zhì)量濃度為1 μg/mL時，殺菌素將病菌完全抑制，在72 h內(nèi)抑菌率達100%。菌絲生長的抑制相應(yīng)地降低了病害的程度，從而起到防治病害的作用。萬壽菊殺菌素水乳劑可用于生產(chǎn)來防治西瓜枯萎病。

大量研究發(fā)現(xiàn)，植物在正常情況下，體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和消除處于平衡狀態(tài)，但在逆境脅迫下該平衡受到破壞，過剩的活性氧可導(dǎo)致蛋白質(zhì)和其他細胞的損傷，嚴重時會導(dǎo)致植物細胞死亡[20]?；钚匝踉谥参矬w內(nèi)的消除則受細胞中包括SOD、POD及CAT在內(nèi)的保護酶系統(tǒng)所控制，這些酶在清除自由基、H2O2和過氧化物，阻止或減少羥基自由基形成方面起著重要作用，且三者協(xié)同作用才可使自由基維持在一個較低水平[21]。在逆境中，植物能通過應(yīng)激反應(yīng)，激活抗氧化劑和誘導(dǎo)抗氧化酶的活性，但隨著時間的延長，活性氧大量產(chǎn)生，SOD，POD和CAT活性下降，活性氧的產(chǎn)生和清除遭到破壞，植株不能正常生長。本試驗結(jié)果表明，西瓜幼苗用毒素和孢子懸浮液處理后，植物通過應(yīng)激反應(yīng)使3種保護酶活性先迅速升高，但隨著時間的延長又出現(xiàn)大幅下降，說明枯萎病菌可以通過破壞細胞保護酶類而傷害植株，但西瓜幼苗在經(jīng)萬壽菊殺菌素水乳劑處理后，SOD，POD，CAT這3種保護酶活性都比對照明顯提高，且在96～120 h開始接近對照，同時在120 h的POD同工酶電泳圖譜中只有西瓜枯萎病菌粗毒素液處理（A處理）檢測到的譜帶較對照少1條，且條帶顏色偏淺，而B處理無明顯不同。說明在萬壽菊殺菌素水乳劑的作用下，植株提高了3種保護酶的活性，加強了對活性氧的清除，降低了病菌對植物體的傷害。

總之，萬壽菊殺菌素水乳劑通過抑制枯萎病菌菌絲的生長和使植株提高過氧化物保護酶活性而降低病菌對植株的傷害程度，從而可起到防治病害的作用。關(guān)于在植物體內(nèi)萬壽菊殺菌素水乳劑如何抑制病菌，如何促進保護酶活性提高的機理還有待于進一步研究。

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