王美琴，趙曉軍，張 鑫，周建波，楊外芬，劉福生

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山西太原030032）

由灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.）侵染引發(fā)的灰霉病是黃瓜生產(chǎn)上的重要病害，在露地、保護(hù)地均有發(fā)生，給黃瓜生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失。由于灰霉病菌具有繁殖速率高、遺傳變異大和適合度高的特性[1-2]，多年連續(xù)大量使用化學(xué)藥劑使該病原菌對(duì)一些殺菌劑產(chǎn)生了抗性。我國(guó)防治灰霉病的殺菌劑品種主要為苯并咪唑類的多菌靈、甲基硫菌靈，二甲酰亞胺類的速克靈、異菌脲以及N-苯氨基甲酸酯類的乙霉威[3]。

國(guó)內(nèi)外已有灰霉病菌對(duì)多種殺菌劑產(chǎn)生抗性，甚至多重抗藥性的報(bào)道[4-6]。山西省各地近年來該病害在黃瓜上的發(fā)生與為害日趨嚴(yán)重，常用殺菌劑的田間防治效果下降。張永杰等[7-9]已報(bào)道了山西省灰霉病菌對(duì)多菌靈、速克靈及乙霉威的抗性，其中，晉中地區(qū)對(duì)這3種殺菌劑的抗性頻率分別為86%，30.3%和26%。

為了解近幾年山西省晉中地區(qū)黃瓜灰霉病菌對(duì)多菌靈、乙霉威及速克靈的抗性頻率和抗性水平的發(fā)展情況，本研究從山西太谷、祁縣和平遙3地的黃瓜病果上分離純化到30個(gè)灰霉病菌菌株，并測(cè)定了其對(duì)這3種殺菌劑的抗性頻率和抗性水平，旨在為生產(chǎn)上合理用藥提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 供試殺菌劑

98%多菌靈原粉和96%乙霉威原粉（均由上海新農(nóng)藥業(yè)公司生產(chǎn)）；97.8%速克靈原粉（由浙江禾益農(nóng)化有限公司生產(chǎn)）。

1.2 菌株的采集與分離

2009年3月，于山西太谷（田豐村和里秀村）、祁縣（東觀鎮(zhèn)和九級(jí)村）和平遙（王家莊）3地的保護(hù)地采集黃瓜灰霉病病果30個(gè)，并采用組織分離法進(jìn)行分離[10]，切取病果內(nèi)病健交界處小塊組織，移在PDA平板中央，待長(zhǎng)出菌絲時(shí)，取菌落邊緣的菌絲轉(zhuǎn)接到另一個(gè)平板上進(jìn)行純化，顯微鏡下觀察是否得到純化的菌種。

1.3 含藥培養(yǎng)基制備

98%多菌靈原藥是用0.1 mol/L稀HCl配成1 000 μg/mL母液，加入2～3滴0.2%的乳化劑Tween 80；96%乙霉威和97.8%速克靈原粉是用丙酮配成1 000 μg/mL母液，以0.2%的量加入乳化劑Tween 80。母液在4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?，用時(shí)以無菌水稀釋至所需的濃度，以1∶10的比例將藥液加入到融化的PDA培養(yǎng)基中充分搖勻，制成含藥平板。

1.4 抗藥性頻率測(cè)定

其測(cè)定采用最低抑制濃度法（MIC），鑒別濃度用Yarden標(biāo)準(zhǔn)[11]，乙霉威和多菌靈以0.5 μg/mL作鑒別濃度，速克靈的鑒別濃度為1.0 μg/mL。用直徑為0.4 cm的打孔器在培養(yǎng)2 d的待測(cè)菌株邊緣取菌塊接種于含鑒別濃度的PDA平板上，每個(gè)處理重復(fù)3次，放在22～23℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，觀察、記錄菌株生長(zhǎng)情況。在鑒別濃度上正常生長(zhǎng)的菌株為抗性菌株。

1.5 抗藥性水平測(cè)定

其測(cè)定采用FAO推薦的菌落直徑法[12]，取1.4鑒別出的敏感菌株3個(gè)和抗性菌株6個(gè)作為待測(cè)菌株，用直徑為0.4 cm的打孔器在待測(cè)菌株菌落邊緣取菌塊，接種于一系列質(zhì)量濃度的含藥平板上。乙霉威敏感菌株的測(cè)試質(zhì)量濃度依次為0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2 μg/mL，抗性菌株為 1.0，1.5，2.0，2.5，5.0，10.0 μg/mL；多菌靈敏感菌株為 0.01，0.02，0.05，0.1，0.2 μg/mL，抗性菌株為 5，10，20，50 ，100 μg/mL；速克靈敏感菌株為 0.05，0.1，0.25，0.5，0.75 μg/mL，抗性菌株為5.0，10.0，15.0，20.0，50.0 μg/mL。以不加藥劑為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。置于22～23℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，測(cè)量菌落直徑。根據(jù)菌落在不同濃度藥劑平板上的生長(zhǎng)抑制率，用SAS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

抗性水平＝抗性菌株EC50/感菌株EC50

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離及培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征

用組織分離法獲得14個(gè)采自山西省太谷縣的黃瓜病果灰霉菌株，編號(hào)為Tg1～Tg14；8個(gè)采自祁縣，編號(hào)為 Qx1～Qx8；8個(gè)采自平遙，編號(hào)為Py1～Py8。初期菌絲呈灰色，并逐漸加深，變灰褐色，在PDA平板上生長(zhǎng)速度較快，48～72 h均可長(zhǎng)滿直徑為9 cm的平板。15 d后在平板上形成黑色、片狀或不規(guī)則的小型菌核。通過鏡檢觀察，病菌的分生孢子梗較長(zhǎng)，多數(shù)叢生，直立，褐色，有隔，頂端具1～2次分支；分支頂端膨大呈頭狀，其上密生小柄，產(chǎn)生大量分生孢子，如同葡萄穗；分生孢子球形至卵球形，無色，單胞，表面光滑。

2.2 灰霉病菌對(duì)3種殺菌劑的抗性頻率

通過MIC法對(duì)分離到的30個(gè)灰霉菌株進(jìn)行室內(nèi)測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，乙霉威的抗性菌株21個(gè)，敏感菌株9個(gè)，抗性頻率為70%；多菌靈的抗性菌株24個(gè)，敏感菌株6個(gè)，抗性頻率為80%；速克靈的抗性菌株27個(gè)，敏感菌株3個(gè)，抗性頻率為90%。

2.3 灰霉病菌敏感菌株對(duì)3種殺菌劑毒力測(cè)定

表1結(jié)果表明，乙霉威敏感菌株的平均EC50為0.036 9 μg/mL，多菌靈敏感菌株的平均EC50為0.057 4 μg/mL，速克靈敏感菌株的平均EC50為 0.269 2 μg/mL。

表1 灰霉病菌敏感菌株對(duì)乙霉威、多菌靈和速克靈的EC50

2.4 灰霉病菌的抗性菌株對(duì)3種殺菌劑的抗性水平

表2結(jié)果表明，乙霉威6個(gè)抗性菌株的EC50在2～3 μg/mL之間，平均抗性倍數(shù)為66.0倍，說明山西省晉中地區(qū)黃瓜灰霉病菌對(duì)乙霉威的抗性達(dá)到中抗。多菌靈抗性菌株的EC50在22～27 μg/mL之間，平均抗性倍數(shù)為421.5倍，說明山西省晉中地區(qū)黃瓜灰霉病菌對(duì)多菌靈的抗性達(dá)到高抗；速克靈抗性菌株的EC50在11～19 μg/mL之間，平均抗性倍數(shù)為53.3倍，說明山西省晉中地區(qū)黃瓜灰霉病菌對(duì)速克靈的抗性為中抗。

表2 灰霉病菌抗性菌株對(duì)乙霉威、多菌靈和速克靈的抗性水平

3 結(jié)論與討論

2003年報(bào)道的有關(guān)山西省晉中地區(qū)灰霉病菌對(duì)多菌靈、速克靈和乙霉威的抗性頻率分別為86%，30.3%和26%[7-9]，本試驗(yàn)測(cè)定的黃瓜灰霉病菌對(duì)這3種殺菌劑的抗性頻率分別為80%，90%和70%，速克靈和乙霉威的抗性頻率均大幅度增加，而多菌靈卻略有下降。分析其原因認(rèn)為，當(dāng)時(shí)在許多地區(qū)灰霉病菌對(duì)多菌靈已經(jīng)達(dá)到高抗，防效降低，以至多菌靈在生產(chǎn)中已經(jīng)停止使用，病原菌對(duì)其的敏感性有所下降，而速克靈和乙霉威仍然是防治灰霉病的常用藥劑，所以其抗性頻率大幅度增加，但其抗性程度集中在中抗水平。建議在生產(chǎn)中要減少速克靈和乙霉威的用藥量或者與其他殺菌劑科學(xué)合理地混合使用，以延緩抗藥性的產(chǎn)生，延長(zhǎng)藥劑的使用年限。

近年來，對(duì)于灰霉病的防治方法，除了使用化學(xué)藥劑外，許多科技工作者也嘗試使用其他的防治方法，如生物防治，篩選拮抗菌株[12-13]，或者用人工嫁接的方法來降低病害的發(fā)生等[14]。

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