張曉萍， 丁永輝， 李玲莉， 張 妍， 倪 琳， 楊 錫

(1．蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州730000;2．甘肅省食品藥品監(jiān)督管理局，甘肅蘭州730000;3．甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730000;4．甘肅省食品藥品檢驗(yàn)所，甘肅蘭州730000)

祖師麻膏藥收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十八冊(cè)》，為祖師麻采用傳統(tǒng)工藝制成的黑膏藥［1］。具有祛風(fēng)除濕，活血止痛功能。用于風(fēng)寒濕痹、瘀血痹阻經(jīng)脈，癥見(jiàn)肢體關(guān)節(jié)腫痛、畏寒肢冷、局部腫脹有硬結(jié)或瘀斑;風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎見(jiàn)上述證候者［2］。祖師麻為瑞香科植物黃瑞香Daphne giraldii Ntcsche．或唐古特瑞香 Daphne tangutica Maxim的干燥根皮與莖皮［3］，主含香豆素類、二萜類、木質(zhì)素類、黃酮類、蒽醌類及甾醇類化學(xué)成分［4-5］，有采用HPLC法測(cè)定原藥材中祖師麻甲素［6-9］、紫丁香苷［10］及其他苯丙素類成分［11］的文獻(xiàn)報(bào)道，但祖師麻膏藥原標(biāo)準(zhǔn)無(wú)定量控制指標(biāo)，為了保證藥品質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定祖師麻膏藥中的祖師麻甲素和紫丁香苷，方法簡(jiǎn)便，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性較好，可以作為該制劑的質(zhì)量控制依據(jù)。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀，Waters 2998二極管陣列檢測(cè)器(PAD);KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);德國(guó)Sartorius R200D型分析天平(十萬(wàn)分之一);上海梅特勒AE240型分析天平(萬(wàn)分之一)。

1．2 試藥 祖師麻甲素對(duì)照品(供定量測(cè)定用，批號(hào):0900-200001)、紫丁香苷對(duì)照品(供定量測(cè)定用，批號(hào):111574-200201)，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;祖師麻膏藥(武威泰康制藥有限公司提供，批號(hào)為 20100503、20100504、20100505)，乙腈為色譜純;水為超純水;其它試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱:CAPCELL PAK MG C18(250 mm ×4．6 mm，5 μm);PAD檢測(cè)器;以乙腈-0．4%磷酸(10∶90)為流動(dòng)相;體積流量1．0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm;柱溫30℃。

2．2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取祖師麻甲素對(duì)照品8．88 mg，置100 mL量瓶中，用85%甲醇溶解并定容至刻度，備用［12］。精密稱取紫丁香苷對(duì)照品5．70 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，備用。分別精密吸取上述祖師麻甲素對(duì)照品溶液10 mL和紫丁香苷對(duì)照品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用85%甲醇定容至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

2．3 供試品溶液的制備 取本品，除去背襯，剪碎，混勻，取約5g，精密稱定，精密加入水50 mL，稱定質(zhì)量，超聲1 h(頻率 40 Hz、功率 250 W)，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液。濾液用0．45μm濾膜過(guò)濾，即得。

2．4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例及制備工藝，配制不含祖師麻藥材的陰性樣品，同法制備陰性樣品溶液。

2．5 方法的專屬性考察 按照上述色譜條件，精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀。結(jié)果:供試品中祖師麻甲素和紫丁香苷與相鄰組分達(dá)到基線分離，且峰形良好，樣品中其他組分對(duì)祖師麻甲素和紫丁香苷的測(cè)定無(wú)干擾，理論塔板數(shù)按紫丁香苷計(jì)不小于4 000。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2．6 線性關(guān)系的考察 取2．2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液(含祖師麻甲素 8．88 μg/mL，紫丁香苷 0．57 μg/mL)10．0、15．0、20．0、25．0、30．0 μL 分別進(jìn)樣，按上述色譜條件記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，祖師麻甲素和紫丁香苷對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:祖師麻甲素Y=2．685 8 ×106X －6．010 ×103，r=0．999 6;紫丁香苷 Y=4．187 6 ×106X －1．373 4 ×103，r=0．999 3。以上結(jié)果表明:祖師麻甲素進(jìn)樣量在0．088 8μg～0．266 4 μg、紫丁香苷進(jìn)樣量在 0．005 7 μg ～0．017 1μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖1 祖師麻膏藥高效液相色譜圖Fig．1 HPLC chromatograms of Zushima Plasters

2．7 精密度試驗(yàn) 取2．2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20μL，結(jié)果:祖師麻甲素的RSD為0．37%，紫丁香苷的RSD為2．21%。

2．8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一個(gè)批號(hào)的祖師麻膏藥(批號(hào):20100505)，平行取樣6份，按2．3項(xiàng)方法操作并檢測(cè)。祖師麻甲素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)0．18 mg/g，RSD為0．76%;紫丁香苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26．54 μg/g，RSD為2．11%，表明方法重復(fù)性較好。

2．9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液(20100505)，于 0、4、8、12、16、20、24 h 按上述色譜條件分別進(jìn)樣20μL，按峰面積計(jì)算，祖師麻甲素的RSD值為0．80%，紫丁香苷的RSD值為1．84%，表明供試品溶液中祖師麻甲素和紫丁香苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．10 回收率試驗(yàn) 取已知量的供試品(祖師麻甲素:0．18 mg/g，紫丁香苷:26．54 μg/g)約 2．5 g，分成3組(每組3份)，置50 mL量瓶中，每組分別精密加入祖師麻甲素對(duì)照品溶液(0．088 8 mg/mL)4、5、6 mL，加入紫丁香苷對(duì)照品溶液(13．2 μg/mL)4、5、6 mL，加水適量，超聲處理 60 min，取出，放冷，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，進(jìn)樣，測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1～2。

表1 祖師麻甲素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab．1 Results of recovery test of daphnetin(n=9)

表2 紫丁香苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab．2 Results of recovery test of syringin(n=9)

2．11 樣品測(cè)定 取3批供試品，同2．3項(xiàng)供試品溶液的制備方法處理樣品，作為供試品溶液。用0．45μm微孔濾膜過(guò)濾，各取續(xù)濾液20μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算樣品中祖師麻甲素和紫丁香苷的量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab．3 Determ ination results of sam ple(n=3)

3 討論

3．1 本實(shí)驗(yàn)比較了不同提取溶劑(甲醇，85%甲醇，水)和不同提取方法(回流法和超聲法)的提取效率，并對(duì)超聲提取時(shí)間(0．5、1、1．5 h)進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示:用超聲法和回流法提取結(jié)果沒(méi)有顯著差異;3種溶劑，甲醇提取液中祖師麻甲素和紫丁香苷量均很低，水和85%甲醇提取液中紫丁香苷的量相差不大，但水提液中祖師麻甲素的量明顯很高，并可排除膏藥基質(zhì)的干擾。因超聲提取更為便捷快速，所以選擇用水做溶劑超聲提取，最佳超聲時(shí)間為1 h。

3．2 我們用PAD檢測(cè)器分別對(duì)祖師麻甲素對(duì)照品溶液和紫丁香苷對(duì)照品溶液在200 nm～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果祖師麻甲素最大吸收波長(zhǎng)為324 nm，紫丁香苷最大吸收波長(zhǎng)為225 nm;因供試品中紫丁香苷量較低，為了提高檢測(cè)方法的靈敏度，選擇225 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，結(jié)果祖師麻甲素和紫丁香苷峰型較好，可滿足定量要求。

3．3 我們?cè)捎梦墨I(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行測(cè)定［13］，但紫丁香苷保留時(shí)間為3 min，影響測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性，通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，確定以乙腈-0．4%磷酸(10∶90)為流動(dòng)相，紫丁香苷、祖師麻甲素和各雜質(zhì)峰均可達(dá)到基線分離，且保留時(shí)間適中。

3．4 本方法具有樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，在同一色譜條件下同時(shí)測(cè)定兩種成分的優(yōu)點(diǎn)，可作為控制祖師麻膏藥質(zhì)量的依據(jù)。

［1］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)(中藥)(衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十八冊(cè))［S］．

［2］毛著鴻，何富春，王錫銀．祖師麻膏藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］．甘肅醫(yī)藥，2010，29(5):562-564．

［3］甘肅省食品藥品監(jiān)督管理局．甘肅省中藥材標(biāo)準(zhǔn)［S］．甘肅:甘肅文化出版社，2009．

［4］康阿龍，湯迎爽，張?zhí)K蘅，等．HPLC測(cè)定祖師麻藥材及不同炮制品中祖師麻甲素［J］．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(16):39-41．

［5］李書(shū)慧，吳立軍，殷紅英．祖師麻化學(xué)和藥理活性研究進(jìn)展［J］．中國(guó)中藥雜志，2002，27(6):401-403．

［6］蔣以號(hào)，楊武亮，陳海芳，等．HPLC測(cè)定不同基源及不同產(chǎn)地祖師麻中祖師麻甲素［J］．中草藥，2008，39(7):1096-1098．

［7］劉亞蓉．唐古特瑞香中祖師麻甲素的HPLC法含量測(cè)定［J］．陜西中醫(yī)，2009，30(1):85-87．

［8］劉 冰，呂曙華，吳貴華，等．高效液相色譜法測(cè)定祖師麻藥材中祖師麻甲素［J］．中草藥，2010，41(5):832-834．

［9］邸立杰，王曉云．祖師麻藥材鑒別及祖師麻甲素含量的測(cè)定［J］．中國(guó)藥事，2008，22(1):43-45．

［10］齊香君，李 楠，單燕鳳，等．HPLC測(cè)定祖師麻中紫丁香苷［J］．中草藥，2005，36(8):1243-1244．

［11］靜蕓蕓，單進(jìn)軍，劉 嘉，等．高效液相法測(cè)定祖師麻中3種苯丙素成分的含量［J］．中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2009，16(3):47-48．

［12］王曉云，邸立杰，劉靜潔．HPLC法測(cè)定祖師麻片中祖師麻甲素的含量［J］．中國(guó)藥事，2003，17(14):232-233．

［13］黨秋萍，周 軍，劉建峰．HPLC法測(cè)定祖師麻藥材中祖師麻甲素的含量［J］．陜西中醫(yī)，2006，27(6):734-735．