師梅梅， 楊建雄， 任 維

(陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062)

荔枝草為唇形科鼠尾草屬植物雪見草Salvia plebeia R．Br．的全草，二年生直立草本，性平，味辛，無毒，在我國和印度分布非常廣泛。國內(nèi)外研究表明，荔枝草的化學(xué)成分主要是黃酮類、二萜類和木酚素類化合物［1-2］，具有止咳平喘、祛痰及抗組胺、抑菌及抗氧化作用［3-4］。但對(duì)其在保護(hù)線粒體方面的作用尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)用多種方法研究荔枝草提取物對(duì)大鼠肝線粒體損傷的保護(hù)作用，為探索荔枝草藥理作用的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 動(dòng)物與材料 SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(200±2)g，由陜西省中醫(yī)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):陜醫(yī)動(dòng)字008-01/025。2，4-二硝基苯肼(DNPH)、抗壞血酸(Vc)、沒食子酸、蘆丁、福林酚試劑、水飽和酚，購自美國Sigma公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。荔枝草全草購買于安徽省中藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為 Salvia plebeia R．Br．，保存在4°C冰箱內(nèi)備用。

1．2 荔枝草提取物的制備 準(zhǔn)確稱取已干燥的荔枝草全草50 g，加10倍量體積70%的乙醇80～82°C回流提取1．0 h，重復(fù)3次，合并所得提取液，60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，然后依次用等體積的石油醚和乙酸乙酯萃取4次，棄醚相，將所得到的水相(SE1)和乙酸乙酯相(SE2)部分經(jīng)減壓濃縮后置于60°C烘箱烘干至恒質(zhì)量。

1．3 荔枝草提取物中有關(guān)成分的分析 以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色體系吸光光度法測(cè)定總黃酮;以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用福林試劑法測(cè)定總酚;以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖。

1．4 大鼠肝線粒體的制備 參照文獻(xiàn)［5］方法進(jìn)行，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，通過Lowry法來測(cè)量線粒體懸浮液中蛋白質(zhì)。

1．5 線粒體損傷模型的建立 在本實(shí)驗(yàn)中，主要采取 Fe2+-Vc體系［6］和 Fe2+-H2O2體系［7］產(chǎn)生·OH，·OH可以使線粒體膜結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)過氧化，損害線粒體膜的通透性，造成ATP合成功能障礙。

1．6 對(duì)肝線粒體脂質(zhì)過氧化的影響 根據(jù)文獻(xiàn)［8］稍作修改，1．0 mL的肝線粒體懸浮液(蛋白含有量為0．50 mg/mL)中加入1．0 mL不同質(zhì)量濃度的 SE 溶液(0．05，0．10，0．20，0．30，0．40，0．50 mg/mL)，混勻后加入6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液100μL和60 mmol/L的過氧化氫溶液40μL，37°C孵育1．0 h，然后加入 15%(w/v)的 TCA 溶液 1．0 mL，搖勻后加入0．67%(w/v)的 TBA 溶液 1．0 mL，搖勻，沸水浴中15 min，冷卻后3 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè) A532nm，空白不加 TBA，對(duì)照不加樣。

1．7 對(duì)肝線粒體腫脹度的影響 3．0 mL的肝線粒體懸浮液(蛋白質(zhì)含有量為1．0 mg/mL)中加入0．40 mL不同濃度的 SE 溶液(0．05，0．10，0．20 mg/mL)混勻后，再加入0．50 mmol/L的硫酸亞鐵溶液0．40 mL和0．50 mmol/L 的 Vc溶液 0．40 mL 激發(fā)反應(yīng)，測(cè)定不同時(shí)間的A520nm［9］。

1．8 對(duì)肝線粒體中蛋白質(zhì)羰基水平的影響 參照文獻(xiàn)［6］的方法稍作修改，1．5 mL的肝線粒體懸浮液(蛋白含有量為0．70 mg/mL)中加入1．0 mL不同濃度的SE溶液，搖勻，依次加入0．50 mmol/L的FeSO4溶液 0．20 mL和 0．50 mmol/L的 Vc溶液0．20 mL，混勻后加入10 mmol/L的DNPH溶液(溶于2．0 mol/L的鹽酸中)0．20 mL，置于黑暗中反應(yīng)1．0 h，每15 min渦旋1次。反應(yīng)完畢后，加入20%的TCA 0．20 mL，冰浴10 min來沉淀蛋白質(zhì)腙衍生物，4．0 ℃下12 000 r/min 離心10min，棄上清，所得到的沉淀用1．5 mL乙醇和乙酸乙酯混合物(體積比為3∶1)洗滌3次，最后的沉淀溶于3%的SDS溶液(溶于pH6．8的磷酸鈉緩沖液)中，在37°C孵育15 min后測(cè)A370nm?？瞻讓?duì)照不加DNPH溶液，用等體積的鹽酸代替。羰基濃度用摩爾消光系數(shù)ε=22 000 L/(mol·cm)來計(jì)算。含羰基量用每1 mg蛋白中含有多少nmol的羰基來表示。

1．9 對(duì)線粒體中ATP酶活性的影響 線粒體損傷用上述的Fe2+-Vc來誘導(dǎo)，ATP酶的活性用每毫克蛋白質(zhì)每小時(shí)中新生成的無機(jī)磷的量(μmol)來表示［10］。

1．10 對(duì)線粒體中O2－·生成的影響 根據(jù)文獻(xiàn)［11］稍作修改，0．20 mL的肝線粒體懸浮液(蛋白含有量約為0．50 mg/mL)中加入1．0 mL不同濃度的SE溶液，混勻后加入混合溶液(100μmol/L NBT，0．25 mol/L 蔗糖，10 mmol/L Tris – HCl(pH 7．4)和2．0 mmol/L 磷酸鉀)2．6 mL，室溫下孵育1．0 h，然后加入 5．0 mmol/L 的琥珀酸鹽溶液 0．20 mL，測(cè)A595nm，樣品對(duì) O2－·的清除率 =(1－A樣/A對(duì)照)×100%。

2 結(jié)果與討論

2．1 提取物得率及有關(guān)成分分析 實(shí)驗(yàn)所得SE1和 SE2 分別為4．741 和4．675 g，得率分別為9．48%和9．35%，SE1中總黃酮、總酚和多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為21．59%、0．29% 和 20．06%，SE2 中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92．09%。

2．2 荔枝草提取物對(duì)脂質(zhì)過氧化的影響 自由基使線粒體、微粒體和溶酶體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的膜上多聚不飽和脂肪酸過氧化，使線粒體、微粒體功能障礙，導(dǎo)致細(xì)胞功能失調(diào)甚至破裂、死亡或凋亡。FeSO4與H2O2誘導(dǎo)肝線粒體膜脂質(zhì)過氧化物MDA生成，可作為·OH誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化的特征。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，在所檢測(cè)濃度范圍內(nèi)，SE均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制脂質(zhì)過氧化的能力，且呈顯著的劑量依賴性關(guān)系，在0．10～0．40 mg/mL范圍內(nèi)，SE2的抑制率略高于SE1，但在較高質(zhì)量濃度(0．50 mg/mL)時(shí)，兩者抑制脂質(zhì)過氧化的能力相當(dāng)，其抑制率分別為96．25%和95．12%。

2．3 荔枝草提取物對(duì)線粒體腫脹度的影響 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)e2+-Vc誘導(dǎo)鼠肝線粒體膨脹的原因是由于膜脂質(zhì)過氧化作用，使膜構(gòu)造改變，膜的屏障功能喪失，膜內(nèi)外離子交換發(fā)生障礙。線粒體氧化損傷后發(fā)生腫脹，表現(xiàn)為其懸液渾濁度下降，在A520nm降低，抑制腫脹，則使其A520nm趨于穩(wěn)定。

由圖1可以看出，隨著時(shí)間的延長各組在A520nm下降，說明線粒體膜被氧化損傷發(fā)生了腫脹，其中正常組變化不大(9．69%)，陰性對(duì)照組下降幅度最大(32．44%)，加樣組下降趨勢(shì)減緩，說明SE可以抑制·OH所導(dǎo)致的氧化損傷，線粒體腫脹減輕，而且呈明顯的量效關(guān)系。在所檢測(cè)的時(shí)間范圍內(nèi)，SE1在0．10和0．20 mg/mL時(shí)的變化分別為22．12%和 17．47%，SE2 在 0．10 和0．20 mg/mL時(shí)的變化分別為20．15%和16．67%，由此可知，SE2抑制線粒體腫脹的能力略好于SE1，并且隨著濃度的增大，兩者的抑制能力逐漸增強(qiáng)。

表1 SE抑制脂質(zhì)過氧化的能力( ± s，n=3)Tab．1 Liver m itochondria lipid peroxidation assay of SE( ± s，n=3)

表1 SE抑制脂質(zhì)過氧化的能力( ± s，n=3)Tab．1 Liver m itochondria lipid peroxidation assay of SE( ± s，n=3)

樣品濃度/(mg/mL) SE1抑制率/% SE2抑制率/%0．05 0．1 0．2 0．3 0．4 0．5 31．37 ±4．28 50．51 ±6．72 66．40 ±2．25 66．67 ±3．47 81．67 ±0．81 95．12 ±0．82 45．5 ±3．16 58．75 ±4．25 76．75 ±1．26 79．75 ±2．49 83．25 ±3．61 96．25 ±1．52

圖1 SE對(duì)線粒體腫脹度的影響( ± s，n=3)Fig．1 Effects of SE on m itochondrialmembrane swelling( ± s，n=3)

2．4 荔枝草提取物對(duì)蛋白質(zhì)羰基水平的影響 蛋白質(zhì)羰基的產(chǎn)生是蛋白質(zhì)分子被自由基氧化修飾的一個(gè)重要標(biāo)記，由于這一特征具有普遍性，因而通過測(cè)定羰基可判斷蛋白質(zhì)是否被氧化損傷，從而評(píng)價(jià)SE對(duì)線粒體的抗氧化活性。

從表2可以看出，經(jīng)Fe2+-Vc誘導(dǎo)后，大鼠肝線粒體中蛋白質(zhì)羰基含有量明顯增多，說明線粒體受到了氧化損傷，加入SE后，蛋白質(zhì)羰基含有量下降，且呈現(xiàn)濃度依賴性趨勢(shì)，即受試物濃度越高，蛋白質(zhì)羰基含有量越低。相比較而言，SE2降低蛋白質(zhì)羰基的能力明顯強(qiáng)于SE1，SE2在0．20 mg/mL時(shí)可使蛋白質(zhì)羰基含有量下降為8．23 nmol/mg，而SE1在該濃度時(shí)只能使其下降為28．23 nmol/mg，SE2在0．40 mg/mL時(shí)即可使蛋白質(zhì)羰基水平恢復(fù)至接近正常水平，SE1則需在1．0 mg/mL時(shí)才能達(dá)到類似效果。

表2 SE對(duì)蛋白質(zhì)羰基水平的影響( ± s，n=3)Tab．2 Effects of SE on mitochondrial protein carbonyl groups( ± s，n=3)

表2 SE對(duì)蛋白質(zhì)羰基水平的影響( ± s，n=3)Tab．2 Effects of SE on mitochondrial protein carbonyl groups( ± s，n=3)

樣品名稱 SE加入量/(mg/mL) 蛋白質(zhì)羰基/(nmol/mg)陰性對(duì)照SE1 SE2正常—0．20 0．40 0．60 0．80 1．00 0．05 0．10 0．15 0．20 0．30 0．40—34．81 ±3．23 28．23 ±1．84 23．20 ±1．26 13．33 ±0．89 9．96 ±1．45 6．96 ±0．54 28．23 ±1．54 21．04 ±2．14 11．86 ±1．03 8．23 ±0．94 7．09 ±0．35 6．41 ±0．42 3．26 ±0．31

2．5 荔枝草提取物對(duì)ATP酶活性的影響 肝臟是能量代謝的重要器官，含有豐富的線粒體，而線粒體是細(xì)胞有氧呼吸的基地和能量供應(yīng)的場(chǎng)所，細(xì)胞生命活動(dòng)約95%的能量來自線粒體。ATP是機(jī)體內(nèi)各種生理活動(dòng)最直接的供能物質(zhì)，它的產(chǎn)生依賴于ATP酶的活性。ATP酶是生物體內(nèi)廣泛存在的一種重要的膜酶，其主要參與細(xì)胞內(nèi)外陽離子的轉(zhuǎn)運(yùn)及能量的供應(yīng)，對(duì)維持細(xì)胞的正常功能十分重要。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見表3)表明，經(jīng)Fe2+-Vc處理后，線粒體ATP酶活性下降，每毫克蛋白質(zhì)每小時(shí)新生成的無機(jī)磷量，由正常時(shí)的6．03μmol下降到3．01 μmol，約下降了50%，加入荔枝草提取物進(jìn)行保護(hù)后，ATP酶活性顯著增強(qiáng)，且在所檢測(cè)濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系，即受試物的濃度越高，酶活性越強(qiáng)。SE1在1．0 mg/mL時(shí)可使ATP酶的活性恢復(fù)到接近正常水平，而SE2在0．40 mg/mL時(shí)就可達(dá)到相似的效果，這充分說明SE2在線粒體受損時(shí)對(duì)ATP酶活性影響較大，也就是說其對(duì)線粒體損傷的保護(hù)能力要強(qiáng)于SE1。

2．6 荔枝草提取物對(duì)O2－·生成的影響 線粒體經(jīng)Fe2+-Vc誘導(dǎo)受到損傷時(shí)，會(huì)產(chǎn)生自由基，主要是O2－·，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定 SE對(duì)線粒體損傷時(shí)產(chǎn)生的O2－·有無清除作用。結(jié)果如圖2所示:在0～0．50 mg/mL范圍內(nèi)，SE對(duì)O2－·的清除能力隨著濃度的升高而增強(qiáng)，且SE2清除能力較SE1強(qiáng)，SE2在0．50 mg/mL時(shí)清除率可達(dá)80．06%，半數(shù)清除濃度IC50為0．29 mg/mL，而SE1在同濃度時(shí)清除率只有68．65%，半數(shù)清除濃度 IC50為 0．36 mg/mL。

表3 SE對(duì)ATP酶活性的影響( ± s，n=3)Tab．3 Effects of SE on mitochondrial ATPase activity( ± s，n=3)

表3 SE對(duì)ATP酶活性的影響( ± s，n=3)Tab．3 Effects of SE on mitochondrial ATPase activity( ± s，n=3)

樣品名稱 SE加入量/(mg/mL) ATP酶活性/μmol陰性對(duì)照SE1 SE2正?！?．20 0．40 0．60 0．80 1．00 0．05 0．10 0．20 0．30 0．40—3．01 ±0．49 3．99 ±0．86 4．50 ±1．02 5．28 ±1．63 5．60 ±1．42 5．66 ±2．51 3．47 ±1．71 4．31 ±1．62 4．71 ±1．54 5．28 ±2．69 5．90 ±2．77 6．03 ±1．26

圖2 SE對(duì)線粒體超氧自由基生成的影響( ± s，n=3)Fig．2 Effects of SE on mitochondrial superoxide anion generation( ± s，n=3)

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SE可以有效地抑制線粒體損傷時(shí)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和線粒體膨脹，降低蛋白質(zhì)羰基的量，恢復(fù)ATP酶的活性，清除線粒體中產(chǎn)生的O2－·，并且呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。SE2和SE1抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和線粒體膨脹的能力均隨著濃度的增大而增強(qiáng)，相比較而言，SE2的作用稍強(qiáng)于SE1;在所檢測(cè)濃度范圍內(nèi)，SE2對(duì)受損線粒體中蛋白質(zhì)羰基含量和ATP酶活性的影響比SE1要顯著的多;SE1和SE2對(duì)線粒體中產(chǎn)生的O2－·都有很強(qiáng)的清除作用，其半數(shù)清除濃度分別為0．36和0．29 mg/mL。SE2的效果較好，可能是該提取物中黃酮含有量較高所致。這一結(jié)論為其在生物體內(nèi)藥理作用的機(jī)制提供一定的依據(jù)，同時(shí)也為其作為抗氧化藥物或食品抗氧化劑提供參考。

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