雷娟利 壽偉松 董文其 張成浩 徐志豪 周艷虹 喻景權

（1浙江省農業(yè)科學院蔬菜研究所，浙江杭州 310021；2浙江大學園藝系，浙江杭州 310029）

嫁接對西瓜根際微生物種群數(shù)量及群落結構的影響

雷娟利1壽偉松1董文其1張成浩1徐志豪1周艷虹2喻景權2

（1浙江省農業(yè)科學院蔬菜研究所，浙江杭州 310021；2浙江大學園藝系，浙江杭州 310029）

分別采用微生物培養(yǎng)的方法、16S rDNA PCR-RFLP方法和phl D基因PCR-RFLP方法研究了嫁接對西瓜根際微生物種群數(shù)量、細菌群落結構及拮抗菌（2,4-DAPG產生菌）群落結構的影響。結果表明:① 嫁接西瓜根際細菌和真菌數(shù)量有所提高，而放線菌數(shù)量則有所減少。② 嫁接西瓜與自根西瓜具有1個相同的主要根際細菌基因型；不同砧木嫁接的西瓜與自根西瓜也分別具有不同基因型的細菌。③ 嫁接西瓜具有與自根西瓜不同的主要根際拮抗菌基因型。

西瓜嫁接；根際微生物；細菌；群落結構；2,4-DAPG產生菌

西瓜〔Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. et Nakai〕是我國主要經(jīng)濟作物，全國各地常形成連片種植的西瓜種植區(qū)域和特色基地。由于市場需求和有限耕地面積的矛盾，以及栽培習慣和經(jīng)濟利益的影響，連作現(xiàn)象普遍，造成連作障礙與枯萎病等病害發(fā)生十分嚴重。西瓜枯萎病是一種分布較廣、危害嚴重、防治困難的一種典型土傳病害。嫁接作為克服土傳病害，消除連作障礙的一項有效技術措施，在西瓜生產上已得到廣泛應用（韓志平 等，2006）。根際微生物群落結構與土傳病害的發(fā)生有一定的內在聯(lián)系，植物土傳病害的發(fā)生在一定程度上是根際微生物群體相互作用的結果。研究表明嫁接改變了茄子根際微生物種群數(shù)量和群落結構，增加了有益菌數(shù)量，進而增強了茄子的抗病性（尹玉玲 等，2008）。然而對于嫁接西瓜根際微生物與土傳病害關系方面的研究報道較少。本試驗通過對嫁接西瓜根際細菌、真菌、放線菌、種群數(shù)量變化及根際細菌與拮抗菌（2,4-DAPG產生菌）群落結構變化的研究，闡明嫁接西瓜根際微生物種群結構與土傳病害的關系，旨在從根際微生物角度進一步揭示嫁接西瓜的抗病機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

接穗為早佳8424西瓜（商品種），砧木分別為南瓜（Cucurbita. moschata Duch.）砧明秀（商品種）和葫蘆〔Lagenaria siceraria（Molina）Standl.〕砧 PH1/PH16，均由浙江省農業(yè)科學院蔬菜研究所提供。西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）生理小種1（Race1）作為接種源。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于細菌的分離和培養(yǎng)，馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基用于真菌的分離和培養(yǎng)，高氏1號培養(yǎng)基用于放線菌的分離和培養(yǎng)（趙斌和何紹江，2002）。

1.2 取樣方法

根際土壤的取樣方法:將根系挖出，抖落大土塊，收集附著在根系上的土壤作為根際土壤。每6株植株根際土壤混合為一個小樣，每個處理取3個平行樣，分別裝入保鮮袋中備用。微生物的分離采用土壤稀釋分離法，每種微生物稀釋濃度均分離3皿（即3次重復）。土壤含水量采用烘干法測定。最后計算每克干土中根際微生物的數(shù)量。

1.3 嫁接西瓜對西瓜枯萎病的抗性鑒定

本試驗于2008年在浙江省農業(yè)科學院水培基地進行，采用插接法嫁接，種植土壤采自基地試驗田。采用盆栽試驗，自根西瓜、南瓜砧嫁接西瓜和葫蘆砧嫁接西瓜，分別種30盆，每盆1株，采用灌根法（張學煒 等，1991）進行西瓜枯萎病抗性鑒定，接種后30 d左右調查發(fā)病率。

1.4 根際微生物總基因組DNA提取

根際微生物總基因組DNA的提取采用UltraClean Soil DNA isolation Kit（Mo Bio Laboratories，Solana Beach Calif，USA），具體操作方法見說明書。提取的DNA大小和質量通過0.8 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.5 根際細菌PCR-RFLP分析

根據(jù)Martin-Laurent等（2001）設計細菌16S rDNA近全長引物（表1），引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。擴增反應在50 μL體系中進行，其中含1 μL（約20 ng）DNA樣品，1.5 mmol·L-1MgCl2，0.25 μmol·L-1正反向引物，400 μmol·L-1dNTPs，1 U Taq DNA 聚合酶及1倍的反應緩沖液。反應程序為:94 ℃變性3 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR產物長約1.5 kb。PCR反應結束后，擴增產物通過1 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將特異性的目的片段用北京鼎國昌盛生物技術有限公司的試劑盒進行切膠純化。純化后的PCR產物與PMD19-T vector（Takara公司）連接過夜，然后轉化 TG1感受態(tài)細胞，挑取白斑篩選陽性克隆。將篩選到的陽性克隆質粒 DNA，取0.5 μL為模板，采用M13引物再進行PCR擴增，所得PCR產物用HinfⅠ和HaeⅢ兩種限制性內切酶37 ℃，4 h進行酶切，酶切完成后用2 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，即獲得限制性片段長度多態(tài)性圖譜。對于條帶數(shù)目與位置相同的，認為其來源于同一細菌16S rDNA PCR-RFLP基因型。對同一基因型的克隆數(shù)進行統(tǒng)計，并計算其基因型頻率。

1.6 根際抗生素2,4-二乙?；冱S酚（2,4-DAPG）產生菌PCR-RFLP分析

根據(jù) McSpadden Gardener等（2001）設計2,4-DAPG產生菌的phl D基因引物B2BF/BPR4。PCR退火溫度為60 ℃，擴增產物長約600 bp。其余操作同1.5。

1.7 多樣性指數(shù)計算

香農多樣性指數(shù)（Shannon diversity index）和辛普森指數(shù)（Simpson’s index）是廣泛應用于生態(tài)學研究的參數(shù)，本試驗也采用這兩個參數(shù)來分析根際樣品的細菌群落多樣性。多樣性指數(shù)的計算通過Biodap（Biodiversity data analysis package）軟件進行分析。

表1 PCR-RFLP分析所用引物

2 結果與分析

2.1 嫁接西瓜抗枯萎病的鑒定結果

通過抗病性鑒定表明（表2），自根西瓜的發(fā)病率為98 %，而南瓜砧嫁接西瓜和葫蘆砧嫁接西瓜的發(fā)病率則均為0，抗病效果達到了100 %，說明嫁接西瓜具有對西瓜枯萎病菌Race1免疫的效果。

2.2 嫁接對西瓜根際微生物種群數(shù)量的影響

通過對嫁接西瓜根際微生物種群數(shù)量的分析表明，嫁接西瓜根際細菌和真菌數(shù)量有所提高，而放線菌數(shù)量則有所減少（表3）。

2.3 嫁接對西瓜根際細菌群落結構的影響

嫁接西瓜根際細菌16S rDNA PCR-RFLP分析表明（圖1），自根西瓜和嫁接西瓜根際共檢測到18個細菌基因型，嫁接西瓜與自根西瓜具有1個共同的根際主要細菌基因型，為基因型2，基因型頻率均達到或超過70 %。不同砧木嫁接的西瓜與自根西瓜也分別具有不同基因型的細菌，如自根西瓜具有8個特有的基因型；南瓜砧嫁接西瓜具有3個特有的基因型；葫蘆砧嫁接西瓜具有1個特有的基因型。從基因型數(shù)來看，自根西瓜的根際細菌基因型數(shù)最多為12，而南瓜砧和葫蘆砧嫁接西瓜的基因型數(shù)則分別為9和5。從多樣性指數(shù)來看，南瓜砧嫁接西瓜與自根西瓜的根際細菌多樣性較高，而葫蘆砧嫁接西瓜的較低（表4）。

表2 嫁接西瓜抗枯萎病鑒定結果

表3 嫁接對西瓜根際主要微生物種群數(shù)量的影響 （DW）

圖1 不同砧木嫁接西瓜根際細菌16S rDNA基因型及其頻率

2.4 嫁接對西瓜根際2,4-DAPG產生菌群落結構的影響

嫁接西瓜根際2,4-DAPG產生菌phl D基因PCR-RFLP分析表明（圖2），共檢測到12個抗生菌基因型，嫁接西瓜與自根西瓜具有不同的主要根際抗生菌基因型，自根西瓜根際抗生菌主要基因型為基因型2，基因型頻率為65 %；而南瓜砧和葫蘆砧嫁接西瓜根際抗生菌的主要基因型均為基因型9，基因型頻率分別為61 %和82 %。自根西瓜與嫁接西瓜共有的抗生菌基因型僅有2個，基因型2（自根西瓜與葫蘆砧嫁接西瓜共有），基因型6（自根西瓜與南瓜砧嫁接西瓜共有）。自根西瓜特有的基因型有5個，南瓜砧與葫蘆砧嫁接西瓜共有的基因型有4個，南瓜砧嫁接西瓜特有的基因型有1個，而葫蘆砧嫁接西瓜未檢測到特有的基因型（圖2）。從基因型數(shù)來看，自根西瓜的抗生菌基因型數(shù)最多為7，而南瓜砧和葫蘆砧嫁接西瓜的抗生菌基因型數(shù)則分別為6和5。從多樣性指數(shù)來看（表5），南瓜砧嫁接西瓜與自根西瓜的根際抗生菌多樣性較高，而葫蘆砧嫁接西瓜的較低。這一結果與根際細菌多樣性的結果相似。

表4 嫁接對根際細菌多樣性的影響

圖2 不同砧木嫁接西瓜根際2,4-DAPG產生菌phl D基因型及其頻率

3 結論與討論

表5 嫁接對根際2,4-DAPG產生菌多樣性的影響

根際微生物與植物生長有著密切的關系，對植物生長具有十分重要的作用（Smith &Goodman，1999）。根際微生物群落結構與土傳病害的發(fā)生也存在著一定的內在聯(lián)系，植物土傳病害的發(fā)生在一定程度上是根際微生物群體相互作用的結果。其中，根際細菌與植物的關系最為密切，對植物的影響作用也最大。有研究表明嫁接茄和自根茄根系分泌物中氨基酸和酚酸在數(shù)量和組成上存在差異，進而影響茄子根際微生物的區(qū)系組成，而且嫁接茄子根際微生物總量也有所增加（朱麗霞 等，2003）。本試驗發(fā)現(xiàn)，嫁接西瓜根際細菌和真菌數(shù)量有所提高，而放線菌數(shù)量則有所減少。通過根際細菌16S rDNA RFLP分析發(fā)現(xiàn)，嫁接也可引起西瓜根際細菌群落發(fā)生輕微改變。

許多研究表明，抑制病害發(fā)生的土壤與熒光假單胞桿菌（Pseudomonas fluorescens）有一定的關系（Weller et al.，2007）。熒光假單胞桿菌是一類普遍存在于土壤中的微生物，是一類重要的根圍和葉圍細菌。其中，產生2,4-DAPG的熒光假單胞桿菌對抑制各類土傳病害起著重要的作用（Raaijmakers et al.，2002）。既然2,4-DAPG產生菌在土壤中廣泛存在，且在抑制土傳病害方面起著重要的作用，因此2,4-DAPG產生菌的基因型及基因型多樣性也被廣泛研究（de La Fuente et al.，2006）。Phl D基因是許多參與DAPG合成的基因中最重要的一個，它對DAPG前體的合成很重要（Bangera & Thomashow，1999）。研究發(fā)現(xiàn)，phl D基因在所發(fā)現(xiàn)的2,4-DAPG產生菌中具有保守性，同時也具有一定的多態(tài)性，很適合作為目的基因研究2,4-DAPG產生菌的基因型多樣性。RFLP和DGGE分析phl D基因已被用于研究2,4-DAPG產生菌的多樣性上（Bergsma-Vlami et al.，2005）。本試驗通過phl D基因的PCR-RFLP技術，對嫁接西瓜根際2,4-DAPG產生菌的基因型多樣性進行了分析，嫁接對西瓜根際2,4-DAPG產生菌的基因型多樣性影響顯著，嫁接西瓜具有與自根西瓜截然不同的根際主要2,4-DAPG產生菌的基因型，據(jù)試驗結果推測嫁接西瓜具有不同的主要2,4-DAPG產生菌的基因型可能與嫁接西瓜的抗枯萎病相關，當然確切的結論還有待進一步研究。

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Effects of Grafting on Rhizosphere Microorganisms Quantity and Community Structure of Watermelon

LEI Juan-li1, SHOU Wei-song1, DONG Wen-qi1, ZHANG Cheng-hao1, XU Zhi-hao1, ZHOU Yan-hong2,YU Jing-quan2
（1Vegetable Institute of Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou310021, Zhejiang, China; 2Horticulture Department of Zhejiang University, Hangzhou310029, Zhejiang, China）

The changes of microorganisms population, bacterial community structure and2,4-DAPG producers community structure in rhizosphere soil of grafted watermelon〔Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. et Nakai〕plants were studied using the methods of microorganism culture,16S rDNA PCR-RFLP and phl D gene PCR-RFLP, respectively. The results showed that the bacterial and fungal population in rhizosphere soil of grafted watermelon was increased and that of the actinomyces population was decreased;the grafted watermelon had one similar main16S rDNA genotype in rhizosphere soil with the non-grafted watermelon, although the grafted watermelon with different stock had their unique16S rDNA genotypes different from non-grafted watermelon; the grafted watermelon had different main2,4-DAPG producers phl D genotypes from non-grafted watermelon.

Grafted watermelon; Rhizosphere microorganism; Bacteria; Community structure;2,4-DAPG producers

S436.5

A

1000-6346（2011）02-0062-05

2010-08-06；接受日期:2010-11-03

國家科技支撐計劃（2008BADA6B02），浙江省自然科學基金（Y3100003）

雷娟利，博士，副研究員，專業(yè)方向:蔬菜病原微生物及蔬菜生物技術，E-mail:juanlil@126.com