王多佳 黃莎莎 李鳳蘭 李金陽 胡寶忠

（東北農業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030）

黃瓜矮化突變體膨脹素Cs-EXPA2基因的克隆與表達分析

王多佳 黃莎莎 李鳳蘭 李金陽 胡寶忠*

（東北農業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030）

采用RT-PCR的方法克隆了黃瓜矮化突變體中膨脹素Cs-EXPA2基因，并對其苗期88 h內生長過程中 mRNA水平表達量的差異進行了研究，探討膨脹素基因對矮化的影響與作用。結果顯示，Cs-EXPA2在黃瓜矮化突變體的下胚軸、根、子葉中均有不同程度的表達，利用Real-time PCR分析得出Cs-EXPA2的表達量隨時空變化，Cs-EXPA2在下胚軸中的表達模式為“低-高-低”，在根中的表達模式為“高-低-高”。

黃瓜矮化突變體；膨脹素；Cs-EXPA2；克??；Real-time PCR

致謝:本試驗得到東北農業(yè)大學園藝學院秦智偉教授的支持，在此對園藝學院黃瓜課題組一并表示感謝。

黃瓜（Cucumis sativus L.）為我國和世界廣泛栽培的蔬菜品種之一，但大多數(shù)黃瓜品種都為蔓生品種，田間栽培占地面積大，土地利用效率低。本試驗選用的黃瓜矮化突變體 D0462，其表型為植株矮小（只有30 cm高），節(jié)間縮短，幾乎不分枝，同時在苗期就表現(xiàn)出下胚軸極度縮短（僅2～3 cm）的明顯矮化性狀（孟婧 等，2009）。利用矮化突變體是選育黃瓜矮化品種的有效途徑，利用這一資源，可以選育適宜機械化操作的品種，增加種植面積，提高生產效率。

自 McQueen-Mason等（1992）從黃瓜下胚軸發(fā)現(xiàn)膨脹素蛋白（Expansin）以來，人們對膨脹素在植物生長中的作用進行了大量研究。研究結果表明，Expansin參與多個器官組織如葉（Fleming et al.，1997）、花（Cosgrove，2000；Pezzotti et al.，2002）、果實（Rose et al.，1997）、根（Wu & Cosgrove，2000）的生長發(fā)育過程，并對細胞壁降解、種子的生長和萌發(fā)、干旱脅迫處理等產生反應（Cho & Cosgrove，2002）。但膨脹素對植物矮化發(fā)育的直接影響報道甚少。本試驗克隆了黃瓜矮化突變體與正常株高品種苗期的下胚軸、根、子葉中的膨脹素基因Cs-EXPA2，并且通過Real-time PCR的方法分析了Cs-EXPA2基因的組織表達差異和時空表達量差異，探討膨脹素基因在矮化黃瓜生長發(fā)育中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

黃瓜矮化突變體 D0462，對照為正常株高品種129，均由東北農業(yè)大學園藝學院黃瓜課題組提供。2009年9月15日于東北農業(yè)大學生命科學學院植物組織培養(yǎng)室內培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，28 ℃光照16 h，20 ℃黑暗8 h，分別在破土后16、24、40、48、64、72、88 h剪取D0462和129的下胚軸、根和子葉作為試驗材料，剪取的組織迅速置于液氮中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA的提取、cDNA的合成及黃瓜Cs-EXPA2基因的克隆

用Trizol法（Invitrigen公司）提取各取樣時間點各器官的總RNA，cDNA第1鏈合成按照Takara公司的PrimeScriptTMRT-PCR Kit反轉錄試劑盒說明書進行。根據(jù)Genebank中Cs-EXPA2（登錄號為U30460.1），使用Primer Premier5.0軟件在CDS兩側設計特異引物，得到1對能有效擴增 Cs-EXPA2編碼區(qū)的引物（FP:5′-TCTGCTCCATCCTTACTTCTTCATCATC-3′；RP:5′-CACCCCTAAACCCACGATCCTAGAC-3′）。以第1鏈cDNA為模板進行中間片段擴增，反應條件為94 ℃5 min，94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃30 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。反應產物經1 %瓊脂糖凝膠檢測后回收，克隆入pMD18-T載體，轉化大腸桿菌DH5α，提取質粒鑒定后由華大基因公司測序。測序結果用DNAMAN軟件分析，并利用NCBI（http://ncbi.nlm.nih.gov/）的BLAST在線分析工具對Genbank的核算數(shù)據(jù)庫序列進行比對分析。

1.3 Real-time PCR分析

TaqMan探針法測定Cs-EXPA2基因的不同時空表達量，利用Primer Express2.0設計熒光定量探針引物，在檢測探針所在靶序列的兩端設計普通引物（FP:5′-GGTGGTGTAACCCTCCGCTT-3′；RP:5′-CCCTGTAAATGCCGATCTTCTG-3′；探針:FAM-AGCATTTCGACATGGCTCAGCCTGCBHQ），擴增200～500 bp片段作為陽性克隆基因。以黃瓜β-actin基因（登錄號為AB010922）為內參，設計探針內參（FP:5′-GTGTGAGTCACACTGTTCCCATC-3′；RP:5′-AGCAAGGTCCAAACGGAGAA-3′；內參探針:FAM-AGGGTTACGCCCTCCCTCATGCC-BHQ1）。引物與探針均由南京博仕公司合成。應用ABI PRISM7500實時定量PCR儀，以各個取樣時間點的cDNA為模板，按照試驗手冊進行PCR擴增。反應程序為:預變性95 ℃30 s，PCR反應40個循環(huán)，95 ℃5 s，60 ℃34 s。反應結束后分析擴增曲線。每個反應3次重復，Ct值取平均值。根據(jù)2-△△ct法（Kenneth et al.，2001）測定基因的相對表達量，每樣品3次重復。

2 結果與分析

2.1 Cs-EXPA2基因的克隆與分析

將黃瓜下胚軸RNA反轉錄后經PCR擴增得到一條大約950 bp的條帶（圖1），將PCR產物與 T載體連接，轉化DH5α后，經藍白斑篩選得到的陽性克隆進行測序。測序結果經 DNAMAN軟件分析表明于該基因有完整的ORF區(qū)，利用NCBI的BLAST在線分析工具與Genbank的核酸數(shù)據(jù)庫序列進行比對分析，二者同源性達到99 %以上，表明Cs-EXPA2克隆成功。

2.2 Cs-EXPA2的時空表達分析

Cs-EXPA2基因在矮化突變體 D0462和正常株高品種129下胚軸中的表達量都呈先增加后降低的趨勢，在破土88 h內都有峰值出現(xiàn)，但矮化突變體較正常株高品種出現(xiàn)峰值的時間晚大約24 h，同時矮化突變體的峰值（破土后48 h）較正常株高品種（破土后24 h）高，但之后迅速降低，甚至降到低于正常株高品種的水平（圖2-a）。

矮化突變體D0462與正常株高品種129根中Cs-EXPA2的表達量在破土16 h內幾乎相等，但之后兩者的表達量都迅速下降，到破土48 h時矮化突變體Cs-EXPA2的表達量超過正常株高品種，但隨后兩者的表達量又都逐漸增加，正常株高品種中Cs-EXPA2的表達量增幅明顯大于矮化突變體，并始終高于矮化突變體（圖2-b）。

矮化突變體D0462子葉中Cs-EXPA2基因的表達量呈增加—降低—增加—降低的模式，破土64 h后表達量基本保持不變，而正常株高品種129則在破土64 h以前表現(xiàn)為下降，64 h以后快速上升，72 h達到峰值隨后又迅速下降到與矮化突變體D0462幾乎一致的水平（圖2-c）。

圖1 Cs-EXPA2基因的擴增結果M，DL2000kb；1，D0462。

圖2 Cs-EXPA2在黃瓜下胚軸、根、子葉中的表達

Cs-EXPA2在矮化突變體子葉中的表達量與正常株高品種在破土64 h前差異不明顯，但在破土后64～72 h正常株高品種Cs-EXPA2的表達量要明顯大于矮化突變體，可以認為子葉在破土后64～72 h細胞生長膨脹的速度最快。

3 結論與討論

膨脹素含量的增加或減少會影響植物生長，已經證實膨脹素基因的過量表達會加快轉基因植物的生長（陳愛國和陳進紅，2003；孫涌棟 等，2008）。而膨脹素基因的表達量也確實對植株的生長有一定的作用，本試驗中黃瓜矮化突變體Cs-EXPA2基因在大多時間的表達量都小于正常株高品種，而在相同時間內，矮化突變體的下胚軸也始終短于正常株高品種129，此結果與孟婧等（2009）的研究結果一致。

膨脹素基因的表達具有時空差異，在不同組織或同一組織不同生長時期的表達量各不相同（Cosgrove & Li，1993）。Harrison等（2001）在研究果實發(fā)育機理時發(fā)現(xiàn)，不同的膨脹素基因在果實發(fā)育過程中存在高-低-高，低-高-低和逐漸增加等3種不同的表達模式，孫涌棟等（2006）在黃瓜果實中克隆得到的CsExp10基因的表達模式為“低-高-低”。Cs-EXPA2基因在矮化突變體D0462與正常株高品種129的下胚軸中的表達模式均為“低-高-低”，而在根中的表達模式為“高-低-高”，子葉中的表達模式大體為“低-高-低”。但D0462與129下胚軸和子葉中Cs-EXPA2表達量峰值出現(xiàn)的時間不同，根中Cs-EXPA2表達量峰值出現(xiàn)的時間卻相同。這可能是由于基因的時空表達差異導致了材料表型上的差異，但Cs-EXPA2到底起到了何種作用還有待進一步的試驗。

已有研究證明，黃瓜植株株高是由單基因體系和多基因體系共同決定的（孫小鐳 等，1990），膨脹素基因是一個多基因家族，包括EXPA、EXPB、EXLA和EXLB，每個家族又有多個亞家族，其中EXPA家族含有12個亞家族（Sampedro et al.，2006）。家族中不同成員可能參與了不同的生長發(fā)育過程（Shin et al.，2005），此前對Cs-EXPA2同一亞家族的Cs-EXPA1的研究發(fā)現(xiàn)，Cs-EXPA1在不同組織的表達量與本試驗中 Cs-EXPA2并不完全相同，其時空表達量也有一些差異（另文待發(fā)表），這也說明了即使同一亞家族的成員其功能也會有差異。由此推斷Cs-EXPA2單個基因的影響不能決定植物的矮化，應該是家族成員共同協(xié)作的結果。單純一個基因的缺失或者表達量的降低并不是植物矮化的決定因素，但可能起到了某種積極的作用。

陳愛國，陳進紅.2003.Expansin 的研究進展.植物學通報，20（6）:752-758.

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Cloning and Expression Analysis of Expansion Cs-EXPA2 Gene in Dwarf Cucumber

WANG Duo-jia, HUANG Sha-sha, LI Feng-lan, LI Jin-yang, HU Bao-zhong*
（Life Science College of Northeast Agricultural University, Harbin150030, Heilongjiang, China）

In this study, we cloned an expansion gene Cs-EXPA2 from dwarf cucumber（Cucumis sativus L.）D0462 by RT-PCR. We quantitatively detected its expression in hypocotyls, roots and cotyledons within88 h during cucumber seedling stage by Real-time PCR. The result shows that the level of its expression may be related to the state of cell growth and division in these sites, and the expression level shows obvious differences at different growth stages. The express quantity of Cs-EXPA2 changes along with temporal and spatial variation. The expression pattern of Cs-EXPA2 in hypocotyls is‘low-high-low’, and the expression pattern in roots is‘high-low-high’.

Dwarf cucumber; Expansion; Cs-EXPA2; Clone; Real-time PCR

S642.2

A

1000-6346（2011）02-0044-04

2010-07-27；接受日期:2010-09-13

黑龍江省自然科學基金（230340），教育部博士后科研基金（200802240008）資助

王多佳，女，博士研究生，專業(yè)方向:植物學，E-mail:wduojia2009@163.com

*通訊作者（Corresponding author）:胡寶忠，教授，博士生導師，專業(yè)方向:植物學，E-mail:bzhu@neau.edu.cn