王柏欣 陳 梅 王淑秋 王 昕 陳廷玉 王景濤 徐 輝 邱洪斌

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

他汀類藥物可競爭性抑制膽固醇合成酶系中的關(guān)鍵酶羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶，使膽固醇合成受到限制。最近，實驗發(fā)現(xiàn)辛伐他汀能減輕腦缺血再灌注損傷〔1〕，其機(jī)制尚未完全闡明。本文在制造大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型的基礎(chǔ)上，探討辛伐他汀抗腦缺血再灌注損傷作用是否與抑制腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞色素C以及線粒體游離鈣的釋放有關(guān)，為擴(kuò)大辛伐他汀的臨床用途提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及分組 健康成年Wistar大鼠，250～300 g，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、辛伐他汀組。模型組和辛伐他汀組都應(yīng)用線栓法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，缺血時間為 30 min，再灌注時間分別為 1、2、3、5、7 d，每個時間點 6 只大鼠。辛伐他汀組在術(shù)后第1天開始，予辛伐他汀20 mg/kg灌胃，假手術(shù)組及缺血再灌注組用相同體積的等滲鹽水灌胃，正常組正常喂養(yǎng)。

1.1.2 試劑 辛伐他汀，浙江京新藥業(yè)股份有限公司提供;大鼠細(xì)胞色素C酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，上海西塘生物試劑公司提供;鈣測定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 建立腦缺血再灌注模型 根據(jù)大腦中動脈栓塞法〔2〕制備腦缺血再灌注模型。予10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，將動物仰臥位固定(上門齒、四肢遠(yuǎn)端用粗線固定于鼠板上)，碘伏消毒頸部皮膚，頸部正中切口，分離出頸總動脈、頸外動脈以及頸內(nèi)動脈，分別接扎頸總動脈及頸外動脈，在頸總動脈距離分叉處將尼龍線導(dǎo)入頸內(nèi)動脈，插入線栓深度約為(18.0±0.5)mm，感到輕微阻力時立即停止插線。然后縫合傷口，留置線頭于體外，30 min后將線拴提至頸總動脈內(nèi)，完成再灌注。術(shù)后將室溫控制在25℃ ～30℃，根據(jù)動物狀況注射速尿或抗生素預(yù)防腦水腫和感染。假手術(shù)組除進(jìn)線1.5 mm外，其余處理相同。辛伐他汀組在模型制作成功后，在術(shù)后第1天開始給藥。

1.2.2 大鼠神經(jīng)功能Longa評分〔2〕無神經(jīng)功能缺失癥狀，活動正常者，計0分;不能完全伸展對側(cè)前爪，計1分;動物爬行時出現(xiàn)向右轉(zhuǎn)圈(追尾現(xiàn)象)，計2分;身體向偏癱側(cè)傾倒者，計3分;不能自發(fā)行走，意識喪失者，計4分。評分為0分和4分者均被剔除，神經(jīng)功能評價在取材前進(jìn)行。

1.2.3 腦組織勻漿的制備 取大鼠，10%水合氯醛麻醉，斷頭取腦，取手術(shù)側(cè)半腦，在冰生理鹽水中仔細(xì)剝離腦膜和血管，剪碎，清洗殘血，沖洗至冰生理鹽水無色澄清，吸水紙吸去多余水分，稱重，剪碎，按稱重量的9倍量取生理鹽水(4℃)，玻璃勻漿器制備成10%腦組織勻漿。

1.2.4 腦組織線粒體游離鈣含量的測定 取制備好的10%的組織勻漿，低溫離心2 000 r/min，10 min，放棄沉淀，取上清液以10 000 r/min低溫離心15 min，沉淀物為線粒體。采用甲基百里香酚藍(lán)比色法測定鈣離子的含量，嚴(yán)格按照說明書中的步驟操作。

1.2.5 腦組織細(xì)胞色素C含量的測定 取10%的腦組織勻漿，低溫3 500 r/min離心，10 min，取上清液。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定腦組織勻漿上清液中細(xì)胞色素C含量，具體步驟按照試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 辛伐他汀對細(xì)胞色素C含量的影響 正常組及假手術(shù)組細(xì)胞色素C表達(dá)很少，而且正常組與假手術(shù)組之間無明顯差異。模型組及辛伐他汀組細(xì)胞色素C表達(dá)明顯增加，與假手術(shù)組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。而且在相同時間段，辛伐他汀組與模型組比較，細(xì)胞色素C的含量明顯減少，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

2.2 各組線粒體游離鈣表達(dá)比較 正常組及假手術(shù)組線粒體游離鈣有基礎(chǔ)表達(dá)，模型組與辛伐他汀組在缺血再灌注后1 d時表達(dá)量最高，隨著再灌注時間的延長其表達(dá)量減少。與假手術(shù)組比較，模型組的鈣離子含量增高，而且具有顯著性差異(P＜0.05);在相同時間點，與模型組比較，辛伐他汀組線粒體游離鈣顯著減少，具有顯著性差異(P＜0.05)。見表2。

表1 各組細(xì)胞色素C表達(dá)比較(±s，n=6，mmol/L)

表1 各組細(xì)胞色素C表達(dá)比較(±s，n=6，mmol/L)

與假手術(shù)組比較:1)P﹤0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;下表同

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表2 各組線粒體游離鈣表達(dá)比較(±s，n=6，mmol/gprot)

表2 各組線粒體游離鈣表達(dá)比較(±s，n=6，mmol/gprot)

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3 討論

細(xì)胞凋亡是在生理和病理條件下的一種主動的死亡方式，受細(xì)胞內(nèi)、外因子調(diào)控的生理學(xué)過程。在腦缺血再灌注的中心區(qū)，由于血液供給急劇減少，細(xì)胞能量供給匱乏，ATP耗竭，Na+/K+泵衰竭，導(dǎo)致大多數(shù)細(xì)胞腫脹、壞死。而在缺血半暗帶區(qū)由于有側(cè)支循環(huán)供血，缺血程度較缺血中心區(qū)輕，存在部分能量供應(yīng)，則細(xì)胞損害相對較輕且進(jìn)展慢。再灌注損傷可產(chǎn)生鈣離子失衡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體功能異常，過氧化作用增強(qiáng)等，這些均可以導(dǎo)致DNA損傷，后者如不能及時修復(fù)，積累到一定程度，則可通過啟動凋亡程序，引起細(xì)胞凋亡，并隨再灌注時間的延長，DNA損傷的積累，凋亡細(xì)胞亦不斷增加〔3〕。研究表明，神經(jīng)元凋亡在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用〔4〕，凋亡神經(jīng)元的多少決定著缺血引起的損害最終范圍大小。腦缺血再灌注和細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，前者通過能量代謝障礙、氧應(yīng)激和鈣超載等導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;而后者同壞死一起，參與缺血-再灌注后細(xì)胞的喪失。在缺血再灌注的過程中，腦組織產(chǎn)生的氧自由基、細(xì)胞內(nèi)鈣超載和線粒體損傷均可誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

線粒體損傷在腦缺血再灌注神經(jīng)元損傷中扮演了關(guān)鍵的角色〔5〕，主要是通過調(diào)控細(xì)胞凋亡而促進(jìn)腦缺血再灌注損傷。線粒體在細(xì)胞存亡機(jī)制，主要有兩方面作用，①由于線粒體膜間隙的細(xì)胞色素C釋放至胞質(zhì)后觸發(fā)caspase級聯(lián)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡;②線粒體外膜上的Bcl-2蛋白家族調(diào)控細(xì)胞色素C自線粒體釋放，因此，細(xì)胞色素C在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生的過程中發(fā)揮著重要的作用。細(xì)胞內(nèi)鈣作為第二信使、代謝調(diào)節(jié)因子和膜穩(wěn)定劑在細(xì)胞正常機(jī)能活動中起重要作用。生理情況下，鈣在細(xì)胞內(nèi)外存在很大的濃度差，這依賴于細(xì)胞膜正常通透性及胞漿鈣離子外排機(jī)制來維持，后一過程需消耗能量。腦缺血缺氧時主要由于ATP供應(yīng)不足、NMDA受體過度興奮介導(dǎo)與其耦聯(lián)的鈣通道開放、膜通透性增大及封阻機(jī)制障礙而致細(xì)胞外鈣內(nèi)流增加、胞漿鈣外排障礙，造成細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高〔6〕。

鈣超載時，一方面刺激線粒體鈣泵攝鈣，使胞漿內(nèi)鈣向線粒體轉(zhuǎn)移，過多的Ca2+與線粒體內(nèi)含磷酸根的化合物結(jié)合成不溶性磷酸鈣，干擾線粒體的氧化磷酸化，使ATP生成減少;另一方面，細(xì)胞內(nèi)游離鈣增加，激活多種鈣依賴性降解酶，導(dǎo)致基質(zhì)水解，損傷細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)鈣超載會引起神經(jīng)元功能和結(jié)構(gòu)完整性破壞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡。而且現(xiàn)在研究表明，Ca2+可能是造成腦缺血損傷各種因素最后作用的共同通路〔7〕。

因此，鈣離子超載以及細(xì)胞色素C的釋放在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中具有重要的意義。本實驗結(jié)果顯示:辛伐他汀可以明顯地降低腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞色素C以及線粒體鈣的含量。推測辛伐他汀具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，而且其機(jī)制可能與抑制損傷后過度表達(dá)的細(xì)胞色素C以及線粒體鈣有關(guān)，但具體的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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6 Honde HM，Korge P，Weiss JN.Mitochondria and ischemia/reperfusion injury〔J〕.Ann NY Acad Sci，2005;1047:248-58.

7 陳 敏，李長青.鈣與腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔J〕.腦與神經(jīng)疾病雜志，2003;11(4):253-5.