邢國芳，杜偉建，張雁明，韓浩坤，韓淵懷

（1．山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷030801；2．山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程研究所，山西 太谷030801）

開花是高等植物生活周期中的一個重要環(huán)節(jié)，花的發(fā)育是植物從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的結(jié)果，光周期是一種植物內(nèi)源的調(diào)節(jié)機制，植物通過感知光周期的變化，來判斷晝夜以及四季的變化。晝夜節(jié)律鐘是指植物體內(nèi)的一種以近似24h為單位的晝夜生理節(jié)奏變化［1］，擬南芥CCA1基因是一個MYB結(jié)合蛋白，它是光周期振蕩器的重要組分，其突變后，植物體的晝夜節(jié)律振幅變短［2］。本研究利用從水稻和擬南芥中分離到的CCA1基因序列作為靶序列BLAST獲取Genbank中的信息，試圖通過RT－PCR克隆玉米中與CCA1同源的基因，并對其進(jìn)行同源性比較分析，另外對該基因在光周期敏感自交系中的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行研究，初步探知該基因的功能，旨在為闡明玉米光周期敏感機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 供試材料

玉米自交系B73，種子均來自同一果穗。將B73盆栽，光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d后（16h光照，25℃；8h黑暗22℃）進(jìn)行光周期處理（16h光照，25℃；8h黑暗22℃），72h后取地上部葉片，從光照0h開始持續(xù)24h，每隔3h取樣，共計9個處理，每個樣品取5株材料，液氮速凍，－80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

按照 Trizol Reagent（Invitrogen公司）試劑盒說明書提取總RNA，并用DNase I酶處理。測A260／280值并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質(zhì)量，用50μL滅菌H2O溶解RNA樣品，并稀釋為1g·L－1用 M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。獲得cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體積20 μL（含2μg總 RNA，1μg random primer，5μL 5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液，5μL 10mmol·L－1dNTP混合物，200UM－MLV反轉(zhuǎn)錄酶，0．5μL RNA 酶抑制子），逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后，取2μL反應(yīng)液用作PCR擴(kuò)增模板。

利用18SrRNA（18S）基因檢測反轉(zhuǎn)錄效果，18SPCR 引 物 為 S1：5＇－ACA TGC GCC TAA GGA GAA ATAG－3＇，S2：5＇－ACC TCC ATG CTC ACT GGT ACT T－3＇。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

1．3 生物信息分析

利用擬南芥水稻中已知的CCA1基因序列在GenBank 中搜索比對玉米的基因組序列和EST序列（http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／Blast．cgi）尋找玉米的CCA1基因序列，并對鑒定出的玉米CCA1基因進(jìn)行進(jìn)化分析和預(yù)測編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析。遺傳進(jìn)化分析利用MEGA 4．1進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建，采用 Bootstrap test－Neighbor Joining方法，重復(fù)500次運算。蛋白結(jié)構(gòu)分析通過PlantsP Feature Scan（http：／／plantsp．genomics．purdue．edu／html／feature＿scan．html）來進(jìn)行，基因結(jié)構(gòu)分析采用 Gene Structure Display Server（http：／／gsds．cbi．pku．edu．cn／）進(jìn)行分析。

1．4 玉米CCA1基因的克隆

根據(jù)1．3所得到的玉米EST序列（EU955544），設(shè)計基因特異引物F1：5＇－CTA CTT CCG TCA GGT CCA GCG T－3＇，F(xiàn)2：5＇－ATA AGG TTT TAA AGC AGT CTA GCG GGC T－3＇，以光照3h處理的cDNA作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收產(chǎn)物，純化后連入PGEM－T載體，轉(zhuǎn)入DH5а感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選挑選陽性克隆，PCR檢測后在華大基因公司測序，獲得玉米CCA1全長編碼序列。分析該序列所翻譯的氨基酸序列，預(yù)測其編碼蛋白的分子量以及等電點大?。╤ttp：／／isoelectric．ovh．org／files／calculate．php）并與水稻、大麥和擬南芥的同源序列比對。

1．5 熒光實時定量PCR分析

1．5．1 引物設(shè)計和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過BLAST分析，獲得與CCA1基因高度同源的玉米基因組序列并進(jìn)行比對，在基因序列的3＇非翻譯區(qū)設(shè)計引物，HQ1：5＇－CCG TAC AGG CTT CAA ACC AT－3＇，HQ2：5＇－TGT GGA TGC TTC GCT ATC AA－3＇，目的片段115bp。以 S1和 S2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆質(zhì)粒作為CCA1和內(nèi)參基因18S的標(biāo)準(zhǔn)品。再將標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋5個梯度，作為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，每個梯度分2次重復(fù)。最后根據(jù)CT值以及稀釋梯度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．5．2 熒光定量PCR體系和數(shù)據(jù)處理

熒光定量 PCR體系含10×PCR buffer 2．5 μL，25mmol·L－1MgCl21．5μL，10mmol·L－1dNTP混合液0．5μL，20×SYBR染料1μL，Plus Taq 0．3μL，20pmol·L－1的上下游引物各0．6 μL，ddH2O 16μL，模板2μL。以18sRNA 為內(nèi)標(biāo)，采用基因特異引物，對不同處理條件下的基因表達(dá)差異進(jìn)行熒光實時定量PCR分析。反應(yīng)程序為：94℃4min，然后94℃30s，58℃30s，72℃30s，35個循環(huán)，72℃ 讀取熒光值；循環(huán)結(jié)束后65℃ 保溫2min，并進(jìn)行熔解曲線分析。

檢測每個樣本的CCA1和18S基因CT值，每份樣品3次PCR重復(fù)，取其平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算定量結(jié)果及校正值。在進(jìn)行結(jié)果分析時，手工設(shè)置熒光域值，確定在該熒光域值下特定的循環(huán)數(shù)CT值，根據(jù)CT值，計算各個處理的C值，C＝2－△CT，ΔCT＝CTCCA1－CT18SC值即為CCA1的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2．1 RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄和檢測

經(jīng)電泳檢測，所提取RNA的28S和18S條帶清晰，A260／280均在1．8～2．1之間，說明 RNA 完整性良好，純度高。用引物S1和S2對cDNA PCR擴(kuò)增均得到211bp的產(chǎn)物，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈質(zhì)量好。

2．2 CCA1基因的克隆和分析

用引物F1和F2以光照3h的葉片cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，克隆回收測序，獲得2326bp序列（圖1），經(jīng)BLAST分析，發(fā)現(xiàn)該基因片段與水稻CCA1高度同源，因此將其命名為ZmCCA1。將其在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST／nr比對，發(fā)現(xiàn)其與水稻相應(yīng)序列（AY452478）相似性可達(dá)73．7%，與大麥相應(yīng)序列（AK360966）相似性達(dá)69．4%，經(jīng) ORF Finder發(fā)現(xiàn)序列中2163bp的開放閱讀框可編碼720個氨基酸，其編碼蛋白的分子量約為78819．17Da，等電點為6．468。

圖1 ZmCCA1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig．1 PCR product of ZmCCA1

氨基酸序列分析以及編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示：ZmCCA1具有3個保守的myb－DNA結(jié)合域、7個N－豆蔻酰化位點、1個G－box蛋白結(jié)合域以及1個推測的蛋白跨膜結(jié)合域（圖2）。其中N－豆蔻?；稽c可以與細(xì)胞膜結(jié)合并向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運，來調(diào)控下游基因的表達(dá)。

圖2 ZmCCA1蛋白結(jié)構(gòu)域分析Fig．2 Conserved domains of ZmCCA1protein

通過DNAMAN軟件分析發(fā)現(xiàn)，CCA1蛋白的保守性很高，其與水稻（AAR20887）、大麥（BAJ92173．1）和擬南芥（NP＿850460．1）MYB蛋白結(jié)合域在氨基酸序列上的相似性分別達(dá)到95．33%、96．26%和79．44%（圖3A）。根據(jù)CCA1蛋白在氨基酸序列上的相似性，利用 MEGA4．0軟件繪制了該蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3B），結(jié)果表明，單子葉植物玉米、水稻、大麥聚在同一個類群。

2．3 ZmCCA1基因染色體定位及結(jié)構(gòu)分析

利用已經(jīng)公布的玉米基因組序列（http／／www．maizesequence．org／）作為參考，通過電子定位將ZmCCA1基因定位于玉米第4染色體的長臂上bin4．04區(qū)域（圖4A），Blast得到其基因組序列，并通過GeneStructure軟件將玉米CCA1基因的基因組序列與cDNA序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)其整個基因組序列包括3個外顯子和2個內(nèi)含子（圖4B）

2．4 ZmCCA1基因的定量表達(dá)分析

2．4．1 標(biāo)準(zhǔn)品鑒定及標(biāo)準(zhǔn)曲線

對構(gòu)建好的18S基因標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行測序，與原基因的同源性為100%。用引物 HQ1、HQ2，S1、S2對標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均得到大小與預(yù)期相同的片段。ZmCCA1基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝－0．279X＋8．045，相關(guān)系數(shù)為0．9945。18S的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝－0．269X＋8．012，相關(guān)系數(shù)為0．9984。兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率相差小，相關(guān)系數(shù)都接近1，熔解曲線均為單峰，表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性強，熒光曲線能夠準(zhǔn)確地反映目的產(chǎn)物的擴(kuò)增。

圖3 不同物種CCA1L基因氨基酸保守域及遺傳進(jìn)化分析Fig．3 Multiple alignment of the CCA1Lconserved domain of maize with those of rice，barley and Arabidopsis in amino acids sequences and the Phylogenetic tree of the CCA1Lprotein

圖4 ZmCCA1染色體定位及基因結(jié)構(gòu)圖Fig．4 Location of ZmCCA1on the maize chromosome and the gene structure

2．4．2 ZmCCA1在光周期處理不同時間點的mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較

圖4顯示，在16h光照／8h黑暗的光周期環(huán)境處理下，ZmCCA1的表達(dá)量變幅很大，在ZT0時，表達(dá)量最高，之后隨日照時間的增加，表達(dá)逐漸下降，到ZT15時，表達(dá)量降到最低，之后隨著黑暗時間的延長，表達(dá)量隨之升高，到ZT24時，表達(dá)量又回升到最高水平。其最高（ZT0）與最低表達(dá)水平（ZT15）相差超過2000倍（圖5，表1）

圖5 ZmCCA1在光周期（16h光／8h暗）條件下的相對表達(dá)水平Fig．5 The relative expression of ZmCCA1at 16hlight／8hdark

表1 ZmCCA1在光周期（16h光／8h暗）條件下的相對表達(dá)量Table 1 ZmCCA1in light cycle（16hlight／8hdark）under the condition of relative expression

3 討論

CCA1和LHY是與生物鐘有關(guān)的一類MYB結(jié)合蛋白類轉(zhuǎn)錄因子［3］，是擬南芥晝夜節(jié)律振蕩器的重要組分［4］，其通過與 TOC1（TIMING OF CAB EXPRESSION）轉(zhuǎn)錄因子的互作形成一個反饋抑制環(huán)，來調(diào)節(jié)植物對晝夜節(jié)律做出的反應(yīng)。其轉(zhuǎn)錄水平會隨著晝夜節(jié)律的變化而改變，而且過量表達(dá)CCA1和LHY不但會導(dǎo)致下胚軸變長和晚花，還會改變它本身和其他一些基因的節(jié)律性表達(dá)［5］；擬南芥中響應(yīng)晝夜節(jié)律的反饋調(diào)節(jié)機制是：清晨時LHY和CCA1表達(dá)水平達(dá)到最高峰，從而使得LHY和CCA1的蛋白量在白天開始時逐漸增加。并抑制TOC1基因表達(dá)，所以在白天TOC1蛋白表達(dá)量逐漸減少，由于TOC1是LHY和CCA1基因表達(dá)所必須的促進(jìn)因子，所以LHY和CCA1基因的表達(dá)量隨著下調(diào)；到夜晚時分，LHY和CCA1蛋白量減少到最低程度，從而可解除對TOC1基因表達(dá)的抑制作用；在夜里，由于TOC1基因表達(dá)上調(diào)，TOC1蛋白量逐漸升高，再次啟動LHY和CCA1基因的表達(dá)，因而凌晨時CCA1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高峰，從而進(jìn)入下一輪循環(huán)［6］。然而最近在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，這一在莖中普遍存在的反饋抑制環(huán)在擬南芥的根系中卻不起作用［7］，另外，發(fā)現(xiàn)早花基因ELF3通過調(diào)控PRR9基因，間接調(diào)控CCA1基因的表達(dá)［8］。說明植物的生物鐘節(jié)律系統(tǒng)相當(dāng)復(fù)雜，可能受內(nèi)外環(huán)境的共同影響。

盡管存在對日照長短的響應(yīng)差異，但是研究發(fā)現(xiàn)長日照植物擬南芥和短日照植物水稻中光周期控制開花時間的遺傳機制卻存在很大的相似之處，水稻和擬南芥的基因組序列分析也表明兩者之間在光周期控制開花時間的分子機制上具有很大的保守性。在水稻中也發(fā)現(xiàn)存在與擬南芥中晝夜節(jié)律鐘基因CCA1、TOC1以及晝夜節(jié)律鐘光輸出基因ZTL 和ELF3相似 的 基 因［9，10］。因 此，我們采用同源克隆的方法，克隆到玉米中的CCA1基因，其保守域與水稻和擬南芥相似性達(dá)90%以上，說明，我們克隆到的ZmCCA1基因在功能上也將與水稻擬南芥中的基因具有相似的功能。另外，我們通過進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，單子葉植物水稻、大麥和玉米中的CCA1同源基因聚為一個類群，而雙子葉植物擬南芥則單獨聚為一個類群，說明CCA1基因在單雙子葉植物進(jìn)化過程中產(chǎn)生了很大的分化。

通過進(jìn)一步的熒光定量PCR檢測，我們發(fā)現(xiàn)ZmCCA1在黎明（ZT0）與黃昏（ZT15）時的表達(dá)量相差2000倍以上，而且，隨著光照時間的增加，其表達(dá)量逐漸降低，到ZT15小時達(dá)到最低，之后，隨著黑暗的來臨，其表達(dá)量則隨之升高，這與擬南芥中其在凌晨表達(dá)最高，而在黃昏表達(dá)最低相一致。進(jìn)一步說明，該基因可能具有與擬南芥中CCA1相同的功能，證明我們克隆的是玉米中的同源基因。因此，我們下一步將構(gòu)建過量表達(dá)和RNAi載體，試圖通過轉(zhuǎn)基因方法進(jìn)一步驗證玉米CCA1基因的功能。由于光周期敏感現(xiàn)象受一個復(fù)雜的多基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)所調(diào)控，需要對該網(wǎng)絡(luò)中的主要關(guān)鍵基因及其相互關(guān)系開展深入研究，以探知其遺傳機制。本實驗室正在對影響光周期敏感效應(yīng)較大的TOC1、GI、CO等關(guān)鍵基因進(jìn)行克隆和克隆驗證，以期為深入解析玉米光周期敏感現(xiàn)象提供實驗證據(jù)。

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