許鄒亮 ，南文龍 ，周 潔 ，陸明哲 ，郭玉廣 ，譚鵬飛 ，毛開榮 ，彭大新 ，陳義平

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心診斷液研究室，山東青島 266032；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 2250093；3．中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 10081）

布魯氏菌病（Brucellosis）是由布魯氏菌（Brucella）引起的一種人畜共患傳染病，可引起流產(chǎn)、不孕和各種組織的局部病灶[1]。本病廣泛分布于世界各地，家畜中牛、羊、豬最常發(fā)生，給畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康都帶來嚴(yán)重危害。近年來，我國人布魯氏菌感染率呈現(xiàn)明顯回升趨勢[2-3]。

目前，布魯氏菌病診斷技術(shù)主要有虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）、乳環(huán)試驗(yàn)（MRT）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）、ELISA和PCR等方法[4]。2000年，Notomi等開發(fā)了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），該方法具有靈敏性高、特異性好、反應(yīng)時(shí)間短、判定結(jié)果方便、不需要昂貴儀器等優(yōu)勢，并開始廣泛應(yīng)用于病毒病、細(xì)菌病、寄生蟲病的診斷[5-7]。本研究建立了布魯氏菌LAMP可視化快速檢測方法，為基層簡便、快捷臨床檢測布魯氏菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Bst DNA聚合酶、AgeⅠ限制性內(nèi)切酶購自New England Biolabs公司；甜菜堿、MgSO4、羥基萘酚藍(lán)（HNB）、鈣黃綠素和蛋白酶 K購自Sigma公司；dNTP、DL 2000 Marker等購自寶生物工程（大連）有限公司；QIAamp DNA Mini Kit購自QIAGEN公司；布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)疫苗株S19、104M、M5和S2由本室保存；牛種布魯氏菌544A（B.abortus 544A）、羊種布魯氏菌16M（B.menlitensis 16M）、豬種布魯氏菌S1330（B.suis 1330）、綿羊附睪種布魯氏菌 63/290（B.ovis63/290）、 犬 種 布 魯 氏 菌 RM6/66（B.canis RM6/66）由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所饋贈；豬大腸桿菌K99、巴氏桿菌C48-1、豬鏈球菌ST171、綠膿桿菌等由本室分離保存；牛布魯氏菌病RBT陽性血清樣本采自布魯氏菌流行區(qū)。

1.2 LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中的布魯氏菌外膜蛋白OMP25基因序列，利用PrimerExplorer V4設(shè)計(jì)一套LAMP引物，其中F3/B3為外引物，F(xiàn)IP/BIP為內(nèi)引物，LF/LB為環(huán)引物；B4/B5為布魯氏菌PCR檢測引物[8-10]（表1）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，用ddH2O溶解后分裝，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 檢測布魯氏菌的引物序列

1.3 細(xì)菌基因組DNA的提取

從甘油葡萄糖瓊脂平板上用0.5%的苯酚生理鹽水將培養(yǎng)好的布魯氏菌洗下，濾液放入70℃水浴鍋滅活1 h。吸取600 μL的細(xì)菌培養(yǎng)物，5000 r/min離心5 min，棄上清。沉淀用540 μL的TE/sodium緩沖液重懸，然后加入 30 μL 10%（w/v）SDS、3 μL 2%（w/v）蛋白酶K，混合后37℃溫育1 h。用酚氯仿對裂解細(xì)胞抽提2次，12000 r/min離心2 min，取上清，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，12000 r/min離心1 min，沉淀溶解在100 μL的TE緩沖液中。測定DNA模板濃度及純度，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 LAMP反應(yīng)體系的建立

優(yōu)化反應(yīng)條件，建立 25 μL 反應(yīng)體系：2.5 μL 10×Thermopol buffer、4 μL MgSO4（50 mM）、1.5 μL dNTPs （25 mM）、4 μL 甜菜堿（5 M）、1 μL Bst DNA polymerase （8 U/μL）、1 μL F3/B3 （5 μM）、1.5 μL FIP/BIP（20 μM）、1 μL LF/LB（20 μM）、1 μL HNB（3 mmol/L）、2 μL Template DNA 和 3 μL ddH2O。63 ℃恒溫反應(yīng)60 min，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)顏色變化觀察結(jié)果。

1.5 LAMP產(chǎn)物的酶切鑒定

建立 25 μL 體系酶切體系：2.5 μL 10×NE Buffer、1 μL AgeⅠ內(nèi)切酶、2 μL LAMP 反應(yīng)產(chǎn)物、14.5 μL ddH2O，37 ℃反應(yīng) 2 h，反應(yīng)結(jié)束后取 5 μL 酶切產(chǎn)物電泳鑒定。

1.6 LAMP方法靈敏性檢測

B.abortus 544A的基因組DNA模板經(jīng)測定濃度后，進(jìn)行10倍系列稀釋，使得濃度梯度依次為85 ng/μL、8.5 ng/μL、850 pg/μL、85 pg/μL、8.5 pg/μL、850 fg/μL、85 fg/μL、8.5 fg/μL、850 ag/μL 和 85 ag/μL。分別取2.0 μL作為LAMP反應(yīng)模板，每個(gè)梯度進(jìn)行三個(gè)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后，直接肉眼觀察反應(yīng)管內(nèi)顏色變化進(jìn)行結(jié)果判定并通過電泳驗(yàn)證。

1.7 LAMP方法特異性檢測

分別提取牛種布魯氏菌544A、104M和 S19、羊種布魯氏菌16M和M5、豬種布魯氏菌S1330和S2、綿羊附睪種布魯氏菌63/290、犬種布魯氏菌RM6/66以及豬大腸桿菌K99、巴氏桿菌C48-1、豬鏈球菌ST171、綠膿桿菌的基因組DNA模板，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，檢驗(yàn)LAMP方法的特異性，反應(yīng)結(jié)束后直接肉眼觀察反應(yīng)管內(nèi)顏色變化進(jìn)行結(jié)果判定。

1.8 臨床樣本檢測

按QIAamp DNA Mini Kit操作說明書分別從60份牛布魯氏菌病RBT陽性血清樣本中提取DNA，各取2 μL的DNA進(jìn)行LAMP和B4/B5-PCR檢測，比較兩種檢出方法的陽性檢出率、符合率。PCR反應(yīng)體系為 12.5 μL 2×Premix Taq Version 2.0，B4、B5（20 μM）各 0.5 μL 以及 2 μL 模板。PCR 反應(yīng)程序是：先95℃解鏈 3 min；而后依次94℃20 s、60℃30 s、72℃30 s，共計(jì) 35 個(gè)循環(huán)；最后 72℃延伸 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.5%凝膠電泳進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 LAMP產(chǎn)物的酶切鑒定

如圖1所示，AgeⅠ特異性酶切后得到176 bp、218 bp和263 bp的條帶，與理論分析相符，證明LAMP擴(kuò)增片段特異。

2.2 LAMP可視化檢測方法的靈敏性

將10倍遞進(jìn)稀釋的B.abortus 544A的基因組DNA加入反應(yīng)液中，于63℃恒溫下反應(yīng)60 min。結(jié)果如圖2所示，發(fā)生LAMP擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)液變?yōu)樘焖{(lán)色，未發(fā)生LAMP擴(kuò)增的仍為紫色。取反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果呈天藍(lán)色的反應(yīng)產(chǎn)物電泳時(shí)均出現(xiàn)階梯狀條帶，表示出現(xiàn)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)（圖3），其顏色變化情況與電泳結(jié)果一致，可以判定本方法的檢測極限約為17 fg。

2.3 LAMP可視化檢測方法的特異性

對9株布魯氏菌和4株陰性對照菌基因組DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，結(jié)果如圖4所示，9株布魯氏菌反應(yīng)管均呈天藍(lán)色，為陽性結(jié)果，4株陰性對照菌反應(yīng)管均呈紫色，為陰性結(jié)果。

2.4 臨床樣本檢測

用建立的LAMP可視化檢測方法對60份RBT陽性的血清樣本進(jìn)行檢測，并與B4/B5-PCR平行檢測的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果如表2所示，B4/B5-PCR檢測為陽性的43份樣品經(jīng)本方法檢測全部為陽性，B4/B5-PCR檢測為陰性的17份樣本，經(jīng)本方法檢測，其中9份為陽性，8份為陰性，兩種方法的結(jié)果符合率為85.0%。

表2 臨床檢測結(jié)果（共60份陽性血清樣本）

3 討論

目前，在LAMP反應(yīng)不開蓋的前提下，其結(jié)果判定方式主要有目視檢查渾濁、目視檢查染料顏色變化和濁度儀對LAMP反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控這三種方法[11]。目視檢查渾濁法主要依據(jù)LAMP反應(yīng)產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀而使反應(yīng)液呈現(xiàn)渾濁，但是當(dāng)渾濁度較低時(shí)，肉眼很難察覺。利用實(shí)時(shí)濁度儀能夠更加直觀、精確地判定結(jié)果，但是需要使用特定的儀器設(shè)備。相比較而言，染料比色分析既提高了肉眼的識別率，又可直接用于疫病的現(xiàn)場診斷，是最為簡單方便的LAMP結(jié)果判定方式。目前，用于LAMP研究常見的染料主要有SYBR Green I、溴化乙錠（EB）、Picogreen、鈣黃綠素和HNB等，其中以SYBR Green I和HNB的檢測靈敏性最高，是鈣黃綠素的10倍[12]。然而SYBR Green I需在LAMP反應(yīng)結(jié)束后加入，增加了擴(kuò)增產(chǎn)物污染的可能。本研究采用的HNB染料于反應(yīng)前加入，穩(wěn)定性好，且陰陽性結(jié)果顏色差別明顯，易于判斷。

LAMP方法是一種高靈敏性的檢測方法，其靈敏性通常比PCR高出10～1000倍，達(dá)到甚至高于熒光定量PCR的檢測水平[11，13]。在分析LAMP反應(yīng)結(jié)果時(shí)，本試驗(yàn)采用HNB染料比色并進(jìn)行電泳驗(yàn)證，兩者結(jié)果一致，說明基于HNB染料的LAMP方法結(jié)果可信。本方法能檢測到約17 fg布魯氏菌基因組DNA，相當(dāng)于5個(gè)布魯氏菌基因組拷貝。另外，R.Ohtsuki等采用LAMP法，在BCSP31基因區(qū)段設(shè)計(jì)引物，也檢測到10 fg的布魯氏菌基因組DNA[13]，其結(jié)果與本研究相符。在進(jìn)行特異性檢測時(shí)，9株布魯氏菌反應(yīng)管全部從紫色變?yōu)樘焖{(lán)色，而4株陰性對照菌反應(yīng)管仍為紫色，顯示本方法良好的特異性。將本方法與經(jīng)典的B4/B5-PCR方法進(jìn)行比較，對60份RBT陽性血清樣本進(jìn)行檢測時(shí)，兩者結(jié)果總符合率達(dá)85.0%。B4/B5-PCR檢測為陽性的43份樣品經(jīng)本方法檢測全部為陽性；B4/B5-PCR檢測為陰性的17份樣本，經(jīng)本方法檢測，其中9份為陽性，8份為陰性。由于B4/B5-PCR的靈敏性通常在1 pg左右，可見本方法的靈敏性明顯高于B4/B5-PCR。

本研究建立了布魯氏菌LAMP可視化檢測方法，整個(gè)反應(yīng)在63℃恒溫條件下進(jìn)行60 min便能直接判定結(jié)果，簡便易行，可用于基層對布魯氏菌的快速檢測。

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