孫興魯 湯欣欣 朱 江 王文兵 史全良 浦冠勤

(1蘇州大學金螳螂建筑與城市環(huán)境學院，江蘇蘇州 215123; 2蘇州大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學與生物科學學院，江蘇蘇州 215123;3江蘇大學生命科學學院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

芋螺毒素(Conotoxin，CTX)是由生活在熱帶海洋中的肉食性軟體動物芋螺(Conus)分泌的，用于麻醉獵物的小肽類毒素。它們多數(shù)是由12～46個氨基酸殘基組成，富含半胱氨酸(Cys)的動物神經肽毒素。芋螺毒素毒性極大，可引起動物出現(xiàn)驚厥、顫抖、甚至麻痹死亡［1］。

目前，國內外已明確功能的芋螺毒素只占了整個毒素庫的很小一部分，但是對它們的生理功能已經有了較為清晰的認識。芋螺毒素二硫鍵骨架和結構的不同，決定了它們功能靶位的差異，已經清楚的靶位主要包括配體門控的離子通道、電壓門控的離子通道及G蛋白偶聯(lián)的受體［2］。芋螺毒素有如下特點:分子質量小，結構多樣;前導肽高度保守而成熟肽具有超變異性;作用靶點廣且具有高度組織選擇性。因而，較之其他生物來源的活性多肽具有更多的優(yōu)越性。

應用昆蟲桿狀病毒對害蟲進行防治，是害蟲綜合防治的一項重要內容。1975年美國環(huán)?？偩峙鷾柿说?個用于防治棉花害蟲的美洲棉鈴蟲核型多角體病毒(Heliothis zeaNPV)殺蟲劑產品登記［3］。但是，野生桿狀病毒殺蟲劑具有殺蟲速度慢、寄主范圍窄、對紫外線敏感等缺點，限制了其作為生物防治因子的廣泛應用［4］。為了提高其殺蟲效力，通常將野生的桿狀病毒進行基因工程改造，包括刪除、修飾昆蟲病毒基因組內的某些非必需基因，如缺失蛻皮激素甾體-UDP 葡萄糖基轉移酶基因(egt)［5－7］以及插入一些對昆蟲特異性的毒素基因，調控昆蟲代謝或發(fā)育的基因以及某些酶基因等外源基因，以構建重組病毒［8－12］。

斜紋夜蛾(Spodoptera litura)是一種多食性的重要農業(yè)和林業(yè)害蟲，危害植物達99科290種以上［13］，在中國、日本、朝鮮、印度以及東南亞地區(qū)經常造成嚴重危害和巨大經濟損失［14－15］。斜紋夜蛾也是桑樹的重要鱗翅目害蟲之一。在我國，斜紋夜蛾核型多角體病毒(SpltMNPV)作為商品化殺蟲劑已推廣使用［16－17］，但仍有野生桿狀病毒殺蟲劑的諸多不足。本研究以繁殖率和毒力極強且基因組中不含有類芋螺毒素成熟肽基因的病毒變異株斜紋夜蛾核型多角體病毒株SpltMNPVⅡ(GenBank:NC_011616)為基礎，構建缺失egt基因，同時在缺失egt基因的部位插入多角體基因啟動子控制的類芋螺毒素成熟肽基因和p10基因啟動子啟動的增強型綠色熒光蛋白基因(egfp)的重組載體，為構建和篩選高效重組SpltMNPV病毒，進一步研究與開發(fā)斜紋夜蛾生物殺蟲劑奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

SpltMNPVⅡ病毒株，由日本岐阜縣生物產業(yè)技術研究所Katsumi Kamiya博士饋贈;斜紋夜蛾TUAT-Spli 221細胞，由日本名古屋大學資源昆蟲研究室Michihiro Kobayashi教授饋贈。苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)病毒株和Sf9細胞，載體質粒pBluescript II SK(+)、轉化用宿主菌E.coliTop10，由蘇州大學基礎醫(yī)學與生命科學學院微生物學研究室保存。Spli細胞和Sf9細胞，用含10%胎牛血清(Invitrogen公司)的TC-100培養(yǎng)基(Invitrogen公司)28℃ 培養(yǎng)。pMD18-egfp，由廣東海洋大學劉艷荷博士饋贈。Ex-Taq DNA聚合酶、限制性核酸內切酶、載體質粒pMD18-T載體、T4DNA連接酶等，均購自TaKaRa公司。

1.2 病毒感染及基因組DNA的提取

實驗使用80 cm2(Corning公司)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的單層貼壁細胞(1×l06cells/mL)，除去培養(yǎng)液后接種1 500μL AcMNPV或SpltMNPV病毒液，感染復數(shù)(MOI:multiplicity of infection)為1，室溫下用震蕩器慢搖1 h，使病毒吸附細胞，然后除去病毒接種液，加入13 mL TC-100培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，28℃培養(yǎng)96 h后收取病毒感染的培養(yǎng)細胞。根據(jù)參考文獻［18］的方法從感染的細胞中提取病毒DNA。

1.3 類芋螺毒素基因的分子克隆

參照GenBank登錄的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)基因組全序列(登錄號:NC_001623)ORF3(Ac-ctx)讀碼框序列，設計一對引物(表1)。以AcMNPV基因組全序列為模板進行PCR擴增，擴增條件為94℃變性5 min，預變性后按94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，擴增30個循環(huán)，72℃延伸10 min后，4℃終止反應。DNA片段分離、連接轉化、質粒制備與純化、限制性核酸內切酶酶切，均按參考文獻［19］的方法進行，構建的重組質粒命名為pMD18-ctx。

表1 用于PCR擴增的引物序列

1.4 重組轉移載體的構建

根據(jù)GenBank SpltMNPVⅡ基因組全序列(NC_011616)分別設計egt上游非編碼端(egt up)，位于egt3'部分片段和egt下游非編碼端(egtdown)，多角體啟動子(Pph)，F(xiàn)蛋白(Fusion protein)的信號肽(Signal peptide)基因引物(表1)。以上引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。DNA片段分離、連接轉化、質粒制備與純化、限制性酶切等分子克隆方法，均按參考文獻［20］的方法進行。

重組轉移載體的構建流程如圖1。以SpltMN-PVⅡDNA為模板，分別擴增出同源重組臂egt上游非編碼端(egtup)、egt3＇端的部分片段和egt下游非編碼端(egtdown)。PCR程序:94℃預變性3 min;94℃變性45 s;55℃退火45 s;72℃延伸90 s，30個循環(huán);72℃再延伸10 min;4℃，10 min。擴增產物回收純化后分別經KpnⅠ/XhoⅠ，NotⅠ/SacⅠ雙酶切后，依次克隆到載體pBluescriptⅡSK(+)上。鑒定為陽性克隆且外源基因插入方向與預期一致后，命名為psk-egtup-egtdown。通過三引物PCR將多角體啟動子基因序列與F蛋白信號肽序列連接，經T-A連接、轉化獲得pUC-Pph-signal P;經XhoⅠ/SmaⅠ雙酶切，將其克隆至psk-egtup-egtdown上，獲得psk-△egt-Pph-signal P;依次克隆Pp10與egfp到質粒pBacPAK8上，命名為pBacPAK8-Pp10-egfp;經BamHⅠ/NotⅠ雙酶切，將其克隆到psk-△egt-Pph-signal P上，命名為psk-△egt-Pph-Pp10-egfp;最后經SmaⅠ/BamHⅠ雙酶切pMD18-ctx，將其克隆到 psk-△egt-Pph-Pp10-egfp上，最終獲得 psk-△egt-Pph-ctx-Pp10-egfp。委托上海生工生物工程技術有限公司進行序列測定。

圖1 重組轉移載體psk-△egt-P p h-ctx-P p10-egfp構建策略

2 結果與分析

2.1 AcMNPV類芋螺毒素基因(Ac-ctx-like)的克隆與序列分析

2.1.1 克隆基因Ac-ctx-like的鑒定 PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，在接近100 bp處可見特異性 DNA擴增帶(圖2)?；厥?Ac-ctx-like的PCR產物，然后與pMD18-T載體連接、轉化，提取質粒。經SmaⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，結果與預期大小一致，表明已成功克隆Ac-ctx-like基因(圖3)。克隆基因委托上海生工生物工程技術有限公司進行序列測定。

圖2 Ac-ctx-like基因的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳鑒定

圖3 pMD18-ctx雙酶切的瓊脂糖凝膠電泳鑒定

2.1.2 克隆基因Ac-ctx-like的序列分析 序列分析表明，Ac-ctx-like基因為162 bp，其中前72 bp為信號肽序列(圖4)。為了更好地進行表達和分泌，本研究使用了斜紋夜蛾F蛋白的信號肽序列，并將該序列構建到轉移載體上，所以克隆的Ac-ctx-like基因是從該基因的第25個氨基酸密碼子開始的90 bp片段。

圖4 Ac-ctx-like基因的DNA序和氨基酸序列

根據(jù)芋螺毒素成熟肽半胱氨酸殘基間的二硫鏈鍵橋的特征性框架排列模式和芋螺毒素前體N端區(qū)域氨基酸的高度保守的信號肽序列，芋螺毒素可以分成A、M、O、P、S、T等多個超家族。又可按照其作用靶位的不同，分為 α、μ、ω、κ、δ、φ 、σ、ρ、γ 及加壓素、驚厥劑和睡眠肽等。根據(jù)Ac-ctx-like基因推定的成熟肽半胱氨酸殘基間的二硫鏈鍵橋的特征性框架排列模式(圖5)，推測該Ac-ctx-like基因可能為類ω-芋螺毒素基因。ω-芋螺毒素是電壓敏感性鈣通道(Voltage sensitive calcium channel，VSCC)阻滯劑，屬于芋螺毒素O超家族［20］。

圖5 ω-芋螺毒素成熟肽半胱氨酸殘基間二硫鏈鍵橋的特征性框架排列模式

2.2 重組轉移載體psk-△egt-P ph-ctx-P p10-egfp的構建與鑒定

2.2.1 Signal P+Pph基因片段的TP-PCR連接與鑒定 由于該重組轉移載體的插入片段較多，為減少載體的限制性酶切位點，采用三引物PCR(TP-PCR)將Signal P基因與Pph基因啟動子序列連接，瓊脂糖凝膠電泳結果表明，連接成功(圖6)。對目的基因片段回收，經連接、轉化獲得質粒pUC-ctx，委托上海生工生物工程技術有限公司進行序列測定，測序結果與預期一致。

圖6 Signal P+P ph基因片段瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2.2 重組轉移載體 psk-△egt-Pph-ctx-Pp10-egfp構建 重組轉移載體構建各階段均經限制性核酸內切酶酶切鑒定，結果正確(圖7－8)。重組轉移載體psk-△egt-Pph-ctx-Pp10-egfp經SmaⅠ /BamHⅠ雙酶切鑒定，ctx片段大小與預期一致(圖9)。經測序證明，重組轉移載體包含了預期的各DNA片段，且克隆方向正確，無突變，上述結果證明該重組轉移載體構建成功。

圖7 重組轉移載體egt up和egt down片段的雙酶切瓊脂糖凝膠電泳鑒定

圖8 重組轉移載體P p10+egfp片段的雙酶切瓊脂糖凝膠電泳鑒定

圖9 重組轉移載體psk-△egt-P ph-ctx-P p10-egfp的雙酶切鑒定

3 討論

SpltMNPVⅡ(SpltMNPV G10-3)是 Kamiya等從日本全國各地野外感病幼蟲收集、分離到189個SpltMNPV克隆中，篩選出的繁殖率和毒力極強的一種新型病毒株［21－22］。本研究是在 SpltMNPV Ⅱ基礎上，利用egt基因同源重組臂DNA序列，成功構建了含有多角體基因啟動子啟動的類芋螺毒素基因和p10啟動子啟動的增強型綠色熒光蛋白(egfp)基因的重組移載體psk-△egt-Pph-ctx-Pp10-egfp。為了使外源基因獲得高效表達，在構建重組轉移載體時，本研究使用了桿狀病毒的強啟動子——SpltMNPV的多角體基因啟動子(Pph)，并通過另一個桿狀病毒的強啟動子——p10啟動子，啟動增強型綠色熒光蛋白作為標記，這樣可大大減少重組病毒的篩選與純化的工作量和時間。本研究在ctx基因前引入了AcMNPV BV膜融合蛋白GP64的同系物，SpltMNPVⅡF(Fusion)蛋白的信號肽序列，可能有利于類芋螺毒素更好地分泌表達。用構建的重組轉移載體與SpltMNPVⅡ在斜紋夜蛾細胞中共轉染，篩選重組桿狀病毒的工作正在進行中。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的芋螺毒素7大超家族，能特異性地作用于體內鉀、鈉、鈣等多種離子通道、細胞膜上的各種神經遞質和激肽的受體，從而干擾細胞或神經中的信號傳遞，有很強的生物學活性［23］。芋螺毒素目前尚無應用于重組桿狀病毒研究的報道，本研究首次從AcMNPV中克隆了昆蟲桿狀病毒基因組中的類芋螺毒素基因，根據(jù)克隆基因的DNA序列及其推定的氨基酸序列的結構分析，推測該基因的表達產物可能類似芋螺毒素O超家族的類ω-芋螺毒素。

昆蟲桿狀病毒作為無公害生物殺蟲劑近年來備受關注，并得到廣泛應用。重組桿狀病毒的研究已成為生物殺蟲劑研究的主要方向。本研究結果將為進一步研制重組斜紋夜蛾核型多角體病毒生物殺蟲劑打下基礎。

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