代學利 王文利 申屠陽 張杰

淋巴轉(zhuǎn)移是肺癌手術(shù)后最常見的擴散途徑。近年來，肺癌VEGF-C和新生淋巴管的表達與淋巴轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系引起研究者的廣泛興趣。其中，不同病理亞型肺癌VEGF-C和新生淋巴管的表達的結(jié)果尚存爭議[1-3]。本文通過研究肺腺癌和鱗癌中VEGF-C和新生淋巴管表達的特征及其與患者術(shù)后生存率的相關(guān)性，以期為臨床提供有益的肺癌預后指標。

1 資料與方法

1.1 患者資料

1.1.1 納入標準 上海市胸科醫(yī)院胸外科1999年1月-2003年12月共行肺癌手術(shù)2,850例，入組標準：①達到肺癌完全性切除標準；②術(shù)后病理證實為IIIa（N2）期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）；③肺腺癌或鱗癌；④有完整的術(shù)后5年隨訪及生存資料。術(shù)后病理診斷不屬NSCLC或未能完全性切除者予以剔除。共計入組98例患者，其中肺鱗癌39例，肺腺癌59例。

1.1.2 資料收集 住院資料以上海市胸科醫(yī)院病案室存檔病史資料為準。生存隨訪資料均來源于上海市疾病預防控制中心。所有患者均進行腫瘤傳報。通過SPSS 13.0數(shù)據(jù)庫采集以下數(shù)據(jù)：住院號、性別、年齡、診斷時年齡、手術(shù)日期、手術(shù)類型、病理類型、T分期、N分期、分化程度、清掃淋巴結(jié)分期組（數(shù)）、陽性淋巴結(jié)組，術(shù)后化療方案及周期。病理診斷根據(jù)2004年世界衛(wèi)生組織頒布的肺及胸膜腫瘤組織學分類（第4版）標準[4]。病理分期按2009版國際抗癌聯(lián)盟肺癌分期標準進行。

1.2 研究方法 統(tǒng)計分析入組患者的臨床特征及生存率，以免疫組織化學染色法檢測所有病灶VEGF-C和新生淋巴管的表達。比較肺腺癌和鱗癌病灶VEGF-C/新生淋巴管的表達特點，評價病灶VEGF-C和新生淋巴管表達的預后價值。

1.3 免疫組織化學研究

1.3.1 研究對象 收集上述98例肺癌患者術(shù)后病灶石蠟標本，共計98塊。

1.3.2 方法及程序 采取檸檬酸鹽緩沖液微波抗原修復法。每例標本切片×2，脫蠟至水。23%H2O2處理10 min，放入盛有檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92oC-98oC之間并持續(xù)10 min-15 min取出容器，室溫冷卻20 min-30 min，切片先用蒸餾水沖洗兩次，再用PBS沖洗，10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min。VEGF-C和podoplanin一抗均為美國R&D公司進口分裝產(chǎn)品，VEGF-C為濃縮液，podoplanin為凍干粉，均用抗體稀釋液（福州邁新公司產(chǎn)品）稀釋，VEGF-C稀釋比為1:50配置成工作液濃度，podoplanin按說明書加入0.2 mL抗體稀釋液稀釋為濃縮液，再按1:100稀釋比配置成工作液濃度。切片以一抗37oC溫育1 h，PBS沖洗3次。二抗為DAKO公司產(chǎn)品，加兔Envinsion室溫30 min溫育，PBS沖洗3次。滴加新鮮配制DAB顯色液（DAKO公司產(chǎn)品），顯微鏡下觀察5 min-10 min，在顯色最佳時用PBS沖洗，中止顯色。蘇木素復染細胞核，然后水洗、藍化、脫水、中性樹膠封片。

1.3.3 VEGF-C表達的觀察和計量 應用日本產(chǎn)Olympus BX51光電顯微鏡對切片進行觀察。VEGF-C在癌細胞內(nèi)的表達顯示胞漿或細胞膜上有黃色或棕黃色顆粒。先在×40倍下觀察整體著色情況，繼而在×100倍下確定染色區(qū)域，再在×200倍下應用Leica Qwin320 plus圖像處理與分析系統(tǒng)進行圖像檢測。病灶VEGF-C表達陽性細胞數(shù)所占百分比計分方法：無陽性細胞數(shù)為0分；陽性細胞數(shù)＜10%為1分；陽性細胞數(shù)10%-50%為2分；陽性細胞數(shù)＞50%為3分。病灶VEGF-C表達陽性細胞染色強度計分：無色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。以上述百分比計分與染色強度計分的乘積獲得VEGF-C表達的等級：0分-2分為（-），3分-4分為（+），5分-7分為（++），8分-9分為（+++）。統(tǒng)計每一級別例數(shù)，以等級資料進行統(tǒng)計。

1.3.4 新生淋巴管表達的觀察和計量 應用日本產(chǎn)Olympus BX51光電顯微鏡進行觀察。先在×40倍下觀察整體著色情況，在×100倍下確定“熱點”區(qū)，即淋巴管密度最高處，在×200倍下進一步區(qū)分著色情況，剔除因成纖維細胞染色而選取的細胞間質(zhì)。新生淋巴管的確定條件為：podoplanin染色為黃色扁平樣、單層管壁無肌細胞和周細胞、管腔內(nèi)無紅細胞出現(xiàn)。單個內(nèi)皮細胞著色亦作為一個計數(shù)單位，不以是否形成管腔和管腔內(nèi)有無淋巴細胞作為計數(shù)標準。然后在×400倍視野下選擇5個不重復的視野計數(shù)，計算每例切片單位視野平均新生淋巴管數(shù)，以微淋巴管密度值表示（lymph microvessel density,LMVD），單位為個。以Mean±SD表示。

1.4 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析均采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行處理。定量資料的分析采用t檢驗，率或構(gòu)成比分析采用χ2檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier乘積法和Log-rank檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson或Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為有差異統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌和鱗癌中VEGF-C的表達及其與病理因素的關(guān)系 肺腺癌和鱗癌中VEGF-C陽性表達呈現(xiàn)棕黃色顆粒（圖1）。98例患者中，共計58例（59.2%）的VEGF-C呈陽性表達。其中腺癌組表達陽性率（71.2%）明顯高于鱗癌組（41.0%）（P=0.003）（表1）。VEGF-C的表達與病理類型相關(guān)，而與T分期、腫瘤大小、分化程度無關(guān)（表2）。

2.2 肺腺癌和鱗癌中新生淋巴管的表達及其與病理因素的關(guān)系 新生淋巴管非均勻分布于腫瘤組織，大部分出現(xiàn)在腫瘤邊緣，而腫瘤內(nèi)的淋巴管大多塌陷（圖2）。新生淋巴管表達數(shù)量以微淋巴管密度值LMVD表示，98例患者中LMVD為（5.00±4.13）個，其中腺癌（6.20±3.81）個，鱗癌（3.95±3.18）個。VEGF-C的表達與病理類型有關(guān)，而與T分期、腫瘤大小、分化程度無關(guān)（表2）。

2.3 肺腺癌和鱗癌中VEGF-C表達與新生淋巴管的關(guān)系98例病灶中，VEGF-C陽性表達為58例，LMVD為（7.67±3.10）個；VEGF-C陰性表達為40例，LMVD為（1.52±1.13）個。VEGF-C表達陽性和陰性者的LMVD間存在統(tǒng)計學差異（t=12.35, P＜0.01）。98例病灶中VEGF-C的表達與LMVD相關(guān)（r=0.749, P＜0.01）。

2.4 生存分析 98例患者的總體5年生存率為38.8%（38/98），中位生存期為（37.53±4.05）個月，肺鱗癌組5年生存率為46.2%（18/39），腺癌組為33.9%（20/59），兩組間無統(tǒng)計學差異（P=0.273）。

2.4.1 單因素分析 VEGF-C表達陽性患者58例，陰性40例，兩者的中位生存期分別為（21.53±2.98）個月和（55.3±4.05）個月， VEGF-C表達陽性者預后較差（χ2=35.48, P=0.001）（圖3A）。如將患者分為高LMVD組（≥5個）和低LMVD組（＜5個），則兩者的中位生存期分別為（21.23±2.22）個月和（53.74±3.24）個月，高LMVD者預后較差（χ2=35.48, P=0.001）（圖3B）。

2.4.2 多因素分析 采用Cox模型對患者年齡、性別、T分期、腫瘤直徑、病理類型、分化程度、VEGF-C表達及LMVD進行多因素分析，發(fā)現(xiàn)僅病灶VEGF-C表達是影響患者術(shù)后生存的獨立預后因素（表3）。

表1 肺腺癌（A）和鱗癌（B）中VEGF-C的表達Tab 1 The expression of VEGF-C in lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma

表2 肺腺癌和鱗癌中VEGF-C和新生淋巴管的表達與病理因素的關(guān)系Tab 2 The relationship between VEGF-C/lymphangiogenesis expression and pathologic factors

圖1 免疫組化法檢測肺腺癌（A）和鱗癌（B）中血管內(nèi)皮生長因子-C （VEGF-C）的陽性表達（×100）。Fig 1 The positive expression of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) in lung adenocarcinoma (A) and squamous cell carcinoma (B) by immunohistochemistry (×100).

圖2 免疫組化法檢測肺腺癌和鱗癌中新生淋巴管的表達。A：紅色橢圓形區(qū)域為新生淋巴管表達區(qū)域（×100）；B：紅色箭頭所指為新生淋巴管（×200）。Fig 2 The expression of lymphangiogenesis in lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma by immunohistochemistry. A: The red elliptical area showed the expression of lymphangiogenesis (×100); B: The red arrow showed the the expression of lymphangiogenesis (×200).

圖3 Kaplan-Meier累計生存時間曲線分析。A：VEGF-C陽性表達患者和陰性表達患者的Kaplan-Meier累計生存時間曲線；B：高LMVD組患者和低LMVD組患者的Kaplan-Meier累計生存時間曲線。Fig3 Kaplan-Meier cumulative survival time curves analysis. A: Kaplan-Meier cumulative survival time curves of VEGF-C positive expression group and VEGF-C negative expression group; B: Kaplan-Meier cumulative survival time curves of higher LMVD (≥5) and lower LMVD (＜5).

表3 肺腺癌和鱗癌患者生存期的預后因素（Cox回歸分析）Tab 3 Prognostic factors for survival in patients with lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma (Cox regression model)

3 討論

早期肺癌患者手術(shù)后遠處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高達60%，成為術(shù)后遠期死亡的重要原因，并最終影響總體療效[5]。介導遠處轉(zhuǎn)移的主要途徑是淋巴和血行，以淋巴轉(zhuǎn)移最為常見。由于淋巴管的基底膜薄且不連續(xù)，不能對腫瘤細胞構(gòu)成有效屏障，因此腫瘤細胞易于侵入淋巴管，此外，新生淋巴管也可從外部長入腫瘤內(nèi)部，使腫瘤細胞被動進入新生淋巴管內(nèi)[4]。

隨著近年來淋巴內(nèi)皮細胞標志物的逐漸發(fā)現(xiàn)，淋巴轉(zhuǎn)移機制的研究有了明顯的進展[6]。Podoplanin是在腎小球足狀突細胞首先證實的一種整合胞質(zhì)胞膜粘蛋白，一度認為，除皮膚某些血管內(nèi)皮細胞外，podoplanin只表達于淋巴管內(nèi)皮，后發(fā)現(xiàn)其在I型肺泡上皮、乳腺肌上皮及食管、肺、肝、直腸和乳腺來源的癌細胞上亦有表達[7]。但相比于曾廣泛應用的VEGFR-3和LYVE-1，由于podoplanin在正常肺組織及肺癌病灶的血管內(nèi)皮上無表達，因而新生淋巴管易于甄別，迄今仍是相對準確的新生淋巴管標記物。

VEGF是一個細胞因子家族，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盤生長因子等。VEGF-C的受體有兩個：VEGFR-2和VEGFR-3，均屬于酪氨酸激酶受體，特異性地存在于內(nèi)皮細胞。相關(guān)研究[8,9]顯示，VEGF-C與VEGFR-3結(jié)合可發(fā)揮明顯、特異的促淋巴管生成作用，同一組織中VEGF-C與VEGFR-3的結(jié)合力是VEGFR-2的3倍，使得VEGF-C的促淋巴管生成作用成為主導，是促進淋巴管新生最重要的因子。腫瘤組織中過表達的VEGF-C不僅誘導淋巴管的新生，而且使腫瘤組織外周淋巴管直徑增加，增加了腫瘤細胞與淋巴管的接觸面積，可能籍此增加腫瘤細胞經(jīng)淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的機會。本研究顯示，對IIIa（N2）期患者而言，隨著VEGF-C表達的增強，新生淋巴管的數(shù)量也逐漸增加，且VEGF-C表達者新生淋巴管的數(shù)量明顯高于無表達者，VEGF-C的表達與新生淋巴管之間存在正相關(guān)性，提示腫瘤組織中VEGF-C的表達可能促進新生淋巴管的生成。有研究[10]認為VEGF-C促進NSCLC的淋巴管生成，有利于腫瘤細胞進入淋巴管發(fā)生轉(zhuǎn)移，盡管存在異議[11]，但作者支持前述新生淋巴管的分子機制。

有研究[12,13]報道，肺癌病灶VEGF-C表達與患者淋巴轉(zhuǎn)移密切關(guān)聯(lián)，在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病灶邊緣淋巴管密度明顯升高，新生淋巴管可作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預測因子。在生存分析的研究中，多數(shù)提示VEGF-C是影響預后的因素[12-15]。此外，有學者[13]報道病灶VEGF-C的表達與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴系統(tǒng)受侵呈正相關(guān)；而病灶淋巴管密度則與VEGF-C表達、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期呈正相關(guān)，認為VEGF-C的表達在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。本研究的單因素分析中，病灶VEGF-C表達患者與無表達者的中位生存期差距明顯，VEGF-C表達者預后較差。多因素分析亦顯示病灶VEGF-C表達是影響患者生存的獨立因素，與前述報道結(jié)論一致，可能與VEGF-C的高表達促進腫瘤細胞經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此VEGF-C的高表達可作為肺癌的高危預測因素。對于病灶新生淋巴管表達，本研究僅單因素分析提示高表達組的中位生存期明顯低于低表達組，新生淋巴管數(shù)量較多者預后較差，但多因素分析并未顯示新生淋巴管密度是獨立的預后影響因素。有研究[11]認為，肺癌患者本身所具有的淋巴管在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的作用比新生淋巴管更重要，新生淋巴管可能起到了促進腫瘤向正常淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌的微血管密度明顯高于肺鱗癌[16]，但是有關(guān)肺腺、鱗癌新生淋巴管的差異結(jié)論不一[1-3]。本研究中，腺癌病灶VEGF-C表達率（71.2%）明顯高于鱗癌組（41.0%）（P=0.003），腺癌病灶新生淋巴管密度平均為（6.20±3.81）個，亦明顯高于鱗癌組（3.95±3.18）個（P=0.001)，且二者與患者年齡、性別、T分期及腫瘤分化程度無明顯相關(guān)性。本研究提示肺腺癌VEGF-C的高表達，可能較肺鱗癌更明顯促進新生淋巴管的生成，使癌細胞經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)移的機率更高，從而影響患者的術(shù)后效果。至于兩組之間并無明顯生存差異，可能因本研究以IIIa期患者為研究對象，患者已然出現(xiàn)縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示肺癌晚期（IIIa）期患者病理分型并非影響生存率的主要因素，這也從另一個側(cè)面印證了病理分期對預后的評估價值。當然，由于兩組病例數(shù)存在明顯傾斜（腺癌59例 vs 鱗癌39例）且總體病例數(shù)有限，有待擴大樣本量進一步研究。

肺癌2009新的國際分期將腫瘤直徑≥7 cm者劃歸為T3，預后明顯差于腫瘤直徑較小者。本研究雖未發(fā)現(xiàn)≥7 cm腫瘤VEGF-C和新生淋巴管的明顯高表達，可見腫瘤直徑的增大并未促進VEGF-C和新生淋巴管的表達，但須提及的是，本研究中腫瘤直徑≥7 cm的比例較低（10/98），而其VEGF-C的表達率卻明顯高于腫瘤直徑＜7 cm者（70% vs 58%），而且LMVD亦較高（6.60±5.46 vs 4.82±3.95），因此，亦有待進一步擴大研究樣本量才能獲得更為可信結(jié)論。