賀永勝，郭小兵，鄧世康，李力燕

(昆明醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所，昆明 650500)

神經(jīng)管畸形所致的神經(jīng)系統(tǒng)先天發(fā)育障礙嚴(yán)重影響了人類的健康，是全世界神經(jīng)科學(xué)工作者所面臨的重要攻堅(jiān)課題。在胚胎脊髓發(fā)育過程中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)發(fā)揮著重要作用，但其作用機(jī)制尚不完全清楚，且絕大多數(shù)的研究局限在實(shí)驗(yàn)性的小動(dòng)物，其具體對(duì)人胚胎脊髓發(fā)育時(shí)期神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化有什么樣的影響，未見明確報(bào)道。鑒于此，本研究擬通過在對(duì)體外培養(yǎng)的人胚胎脊髓神經(jīng)干細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)BDNF的水平，觀察外源性和內(nèi)源性BDNF對(duì)人胚脊髓神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的影響。希望為人類胚胎脊髓發(fā)育機(jī)制、缺陷機(jī)制及其預(yù)防和臨床治療提供直接的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 經(jīng)云南省昆華醫(yī)院和孕婦本人同意，獲取孕20周水囊引產(chǎn)胎兒脊髓組織標(biāo)本;細(xì)胞培養(yǎng)板購自Costar公司，DMEM/F12購自Hyclone公司，多聚賴氨酸、胰酶、噻唑藍(lán)(MTT)購自 Sigma公司，人重組腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子購自Peprotech公司，B27添加劑、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblastgrowth factor，b-FGF)、表皮生長(zhǎng)因子購自Invitrogen公司，兔抗人BDNF抗體，兔抗人神經(jīng)元特異性核抗原(NeuN)抗體、兔抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體購自 Millipore公司，兔抗人巢蛋白(Nestin)抗體購自 Santa Cruz公司，封閉用正常羊血清、PV9000試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分離培養(yǎng) 在無菌環(huán)境下，剝離流產(chǎn)胎兒胸腰段脊髓組織，除去脊膜后，將組織放于適量的0.25%胰酶液中，37℃培養(yǎng)箱中消化5 min，拿出后輕輕吹打，以1∶1比例用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止，吸取細(xì)胞懸液于離心管中1000 r/min離心5 min，吸棄上清，加入含B27(1∶100)、表皮生長(zhǎng)因子(20 μg/L)和 b-FGF(20 μg/L)的DMEM/F12培養(yǎng)基(B27培養(yǎng)基)，以5×105/mL的密度接種入六孔板中，放入37℃含5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3～4 d半量換液一次。

1.2.2 神經(jīng)干細(xì)胞Nestin染色鑒定 培養(yǎng)10 d后，離心提取細(xì)胞，加入無菌的磷酸鹽緩沖液清洗3次，加入2 mL無菌的4%多聚甲醛在4℃條件下固定細(xì)胞30 min，無菌磷酸鹽緩沖液洗滌3次，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，含0.1%Triton的5%羊血清室溫下孵育1 h后，加兔抗人Nestin抗體(1∶200)4℃過夜，加PV-9000二抗37℃孵育30 min，DAB液顯色，顯微鏡下觀察鑒定結(jié)果。

1.2.3 神經(jīng)干細(xì)胞的分組培養(yǎng) 在第一次半量換液時(shí)，將細(xì)胞均分為正常對(duì)照組、BDNF蛋白組、BDNF抗體封閉組，其中 BDNF蛋白組換液為含40 μg/L BDNF蛋白的B27培養(yǎng)基，BDNF抗體封閉組換液為含有BDNF抗體(1∶1000)的B27培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)獨(dú)立孔(n=6)。每天觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，3 d半量換液一次。在培養(yǎng)第7天拍照取得結(jié)果圖片，每孔取5個(gè)視野拍攝圖片，計(jì)數(shù)每孔中各視野神經(jīng)球數(shù)目并取均值。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 各組細(xì)胞在培養(yǎng)第10天，1000 r/min離心提取細(xì)胞，以每孔2000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)10個(gè)平行孔(n=10)，每孔加100 μL B27 培養(yǎng)基，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜，第2天換液為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入20 μL MTT溶液(濃度5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，37℃搖床上低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀上測(cè)其OD值。

1.2.5 分化檢測(cè) 在培養(yǎng)第10天，離心收集細(xì)胞，接種至多聚賴氨酸包被的六孔板中，各組分別加入對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，倒置顯微鏡下觀察分化情況，輕輕吸棄培養(yǎng)基后按上述步驟進(jìn)行NeuN和GFAP免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)。每組6孔，每孔取5個(gè)視野進(jìn)行拍照獲取結(jié)果并進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人胚胎脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 在培養(yǎng)第1天，細(xì)胞呈單個(gè)透亮懸浮生長(zhǎng)，72 h后開始分裂增殖呈桑葚狀聚集，在培養(yǎng)第10天神經(jīng)干細(xì)胞成典型神經(jīng)球樣生長(zhǎng)，神經(jīng)球中心細(xì)胞由于缺乏營(yíng)養(yǎng)而出現(xiàn)老化凋亡，倒置顯微鏡下觀察見透光度較差，神經(jīng)球周邊部細(xì)胞增殖迅速，細(xì)胞透亮(圖1A)。經(jīng)免疫組織化學(xué)Nestin染色后顯示陽性，表明所培養(yǎng)細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞(圖1B)。

圖1 培養(yǎng)10 d時(shí)的人胚胎脊髓神經(jīng)干細(xì)胞球及鑒定染色圖

2.2 各組神經(jīng)球數(shù)目計(jì)數(shù)結(jié)果 對(duì)三組的神經(jīng)球細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.470，P＜0.05)。如表1所示，與對(duì)照組比較，加入BDNF蛋白后，神經(jīng)球數(shù)目沒有明顯變化(P＞0.05);而加入BDNF抗體后，神經(jīng)球數(shù)目比對(duì)照組有顯著減少(P ＜0.05)。

表1 各組神經(jīng)球數(shù)目計(jì)數(shù)結(jié)果

2.3 各組MTT檢測(cè)結(jié)果 三組細(xì)胞的MTT進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.225，P ＜0.05)。如表2所示，BDNF蛋白組的OD值與對(duì)照組比較無明顯差異(P＞0.05)，而抗體封閉組的OD值與照組相比有顯著減弱(P ＜0.05)。

表2 各組MTT細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果

2.4 各組神經(jīng)干細(xì)胞分化情況

2.4.1 神經(jīng)干細(xì)胞貼壁后分化為NeuN和GFAP陽性細(xì)胞 在培養(yǎng)第10天半量換液后將神經(jīng)干細(xì)胞接種至多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板中，可見神經(jīng)球貼壁后出現(xiàn)分化，其周邊開始出現(xiàn)長(zhǎng)的細(xì)胞突起(圖2A)，周圍增殖的細(xì)胞開始出現(xiàn)一定的細(xì)胞形態(tài)(圖2B)，48 h后進(jìn)行免疫組化染色，可見神經(jīng)元軸突細(xì)長(zhǎng)，胞體呈橢圓形(圖2C箭頭所示)，星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體呈多邊形，從胞體發(fā)出多個(gè)突起(圖2D箭頭所示)。

圖2 神經(jīng)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)后分化為NeuN和GFAP陽性細(xì)胞

2.4.2 各組NeuN陽性細(xì)胞數(shù)比較 對(duì)三組細(xì)胞的NeuN陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.976，P ＜0.05)。BDNF 蛋白組的陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，而BDNF抗體封閉組的NeuN陽性細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組有顯著減少(P ＜0.05)(表3)。

表3 各組干細(xì)胞分化為NeuN陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果

2.4.3 各組GFAP陽性細(xì)胞數(shù)比較 三組細(xì)胞的GFAP陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.266，P ＜0.05)。與對(duì)照組相比，加入 BDNF 蛋白后GFAP陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少(P=0.019，P ＜0.05)，而經(jīng)過抗體封閉后的GFAP陽性細(xì)胞數(shù)目也明顯少于對(duì)照組(P ＜0.05)(表4)。

表4 各組神經(jīng)干細(xì)胞分化為GFAP陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

3 討論

神經(jīng)干細(xì)胞是一類可在體內(nèi)體外增殖分化的細(xì)胞，Gage［1］將神經(jīng)干細(xì)胞概括為可生成神經(jīng)組織或者來源于神經(jīng)系統(tǒng)的具有自我更新能力，并且能夠通過不對(duì)稱細(xì)胞分裂產(chǎn)生的新細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和研究改變了成年后腦神經(jīng)元不可再生的傳統(tǒng)觀念，它在神經(jīng)系統(tǒng)退行性變及神經(jīng)系統(tǒng)損傷的功能恢復(fù)方面具有廣泛的應(yīng)用前景。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)不同種屬、同一種屬不同部位以及不同年齡(胎齡)所分離得到的神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)特性也有所不同［2］。目前的研究均集中在大鼠等嚙齒類動(dòng)物，而由于種屬基因的差異性，人與嚙齒動(dòng)物的脊髓神經(jīng)干細(xì)胞之間存在很大不同，在培養(yǎng)條件以及對(duì)各類生長(zhǎng)因子的反應(yīng)特性也不相同。在對(duì)人胚胎期神經(jīng)干細(xì)胞的研究中，已先后從大腦皮質(zhì)、海馬、紋狀體、嗅球、側(cè)腦室、室管膜下層、小腦和脊髓等區(qū)域分離出神經(jīng)干細(xì)胞［2］。

BDNF是神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族的成員之一，由Barde于 1982 年從豬腦中提純獲得［3］，BDNF 由120個(gè)氨基酸組成，與神經(jīng)生長(zhǎng)因子有54%的同源性，其表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中具有時(shí)空特異性，能影響神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和成熟［4］，與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育密切相關(guān)。BDNF可參與神經(jīng)干細(xì)胞的趨化和遷移運(yùn)動(dòng)［5］，使得神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞能夠準(zhǔn)確到達(dá)目標(biāo)損傷部位并存活、增殖、分化且與宿主神經(jīng)細(xì)胞建立突觸聯(lián)系。有報(bào)道提示，體外培養(yǎng)的胎鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞可分泌BDNF、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子［6］。已有研究也已證實(shí)嚙齒類動(dòng)物種屬中BDNF可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，且可誘導(dǎo)神經(jīng)元突起的延伸［7，8］。那么，BDNF在人胚胎脊髓神經(jīng)干細(xì)胞中的作用及其機(jī)制如何?

本課題組在實(shí)驗(yàn)前期系統(tǒng)的研究了從第3周到第8個(gè)月的人胚胎發(fā)育脊髓中BDNF的定位及定量表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)BDNF廣泛地分布于人胚胎脊髓發(fā)育的各個(gè)時(shí)期，特別是在早期胚胎中發(fā)揮著重要的作用，而且在脊髓的中央管上皮從最初的假復(fù)層柱狀神經(jīng)上皮到后期柱狀上皮的室管膜細(xì)胞，幾乎在所有的檢測(cè)時(shí)段都發(fā)現(xiàn)有BDNF的表達(dá)［9］，而這些部位都是神經(jīng)干細(xì)胞的聚集之處。

本研究結(jié)果提示，在人胚胎脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及分化過程中BDNF發(fā)揮了重要作用，在加入外源性BDNF蛋白后，雖然神經(jīng)球的數(shù)目和活力與對(duì)照組相比沒有明顯變化，但在用BDNF抗體封閉了神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)源性的BDNF蛋白后，神經(jīng)球數(shù)目出現(xiàn)減少，細(xì)胞活力也有明顯下降。說明在神經(jīng)干細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)過程中BDNF起著不可或缺的作用，在加入外源性BDNF蛋白未能明顯促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和活力，其原因可能是由于內(nèi)源性BDNF的分泌已達(dá)到一個(gè)飽和的程度，或由于BDNF的功能性受體缺乏而導(dǎo)致剩余量的BDNF蛋白不能得到激活，以致不能引起B(yǎng)DNF下游目的基因的表達(dá)來促進(jìn)干細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。

對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞的研究目前還處于起步階段，隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展，在神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的機(jī)制及應(yīng)用等發(fā)面已經(jīng)取得了初步成果，BDNF在神經(jīng)分泌細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化過程中扮演重要角色，但仍有一些問題尚待解決:①如何應(yīng)用BDNF精確控制神經(jīng)分泌細(xì)胞分化為神經(jīng)元的數(shù)量和方向;②如何誘導(dǎo)分化出的神經(jīng)元向目標(biāo)區(qū)域延伸并與其他神經(jīng)元發(fā)生突觸聯(lián)系;③如何應(yīng)用BDNF調(diào)動(dòng)并誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化。這些問題的解決將對(duì)神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展有一個(gè)革命性的推動(dòng)作用。

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