張 麗,范鳴浩,宋益民,張學成

(1.青島科技大學化工學院,山東青島266042;2.中國海洋大學海洋生命學院,山東青島266003)

雨生紅球藻紫外誘變及抗銨品系篩選3

張 麗1,2,范鳴浩1,2,宋益民1,2,張學成233

(1.青島科技大學化工學院,山東青島266042;2.中國海洋大學海洋生命學院,山東青島266003)

經(jīng)紫外誘變,篩選出在碳酸氫銨濃度為400 mg/L條件下可以生存的突變株。通過培養(yǎng)基中氮、磷、鐵、溫度、光照及p H值對雨生紅球藻誘變株生長的影響進行比較,對以上3種營養(yǎng)鹽及3種環(huán)境因子分別進行三因素三水平正交實驗,以優(yōu)化培養(yǎng)條件。進而對雨生紅球藻野生型及誘變株的生長狀況及色素含量進行比較。實驗結果表明,雨生紅球藻抗銨品系在培養(yǎng)基中NaNO30.1 g/L,KH2PO40.01 g/L,FeCl3·6H2O 1.0 mg/L,在p H值為8.0,光照強度100μmol· m-2·s-1,溫度為18℃的培養(yǎng)條件下,雨生紅球藻的生物量得到有效提高。

雨生紅球藻;紫外線;誘變;碳酸氫銨;正交實驗

雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)屬綠藻門團藻目紅球藻科[1],在適宜條件下,以綠色游動細胞形式存在,在脅迫條件下,如氮缺乏、高光強及鹽脅迫條件下,綠色游動細胞失去游動能力,變?yōu)楹癖诘牟粍蛹毎⒎e累大量蝦青素(Astaxanthin)[2]。蝦青素是良好的著色劑并具有超強的抗氧化、抗癌變、抗紫外線輻射及增強免疫等功能,在醫(yī)藥、食品、化妝品和水產(chǎn)餌料等領域有廣泛的用途[324]。雨生紅球藻中蝦青素含量可達藻體干重的2%～4%[5],為微生物中類胡蘿卜素含量的10～50倍,被公認為自然界中天然蝦青素含量最高的生物,是用來獲取天然蝦青素的理想材料[6]。規(guī)模化培養(yǎng)雨生紅球藻是獲取天然蝦青素的最佳途徑,因此,近幾年來關于雨生紅球藻的品系選育、培養(yǎng)條件優(yōu)化和大規(guī)模養(yǎng)殖成為微藻領域的研究熱點之一。

但是,雨生紅球藻養(yǎng)殖過程中,輪蟲、纖毛蟲等原生動物及其他微型藻類都嚴重地影響雨生紅球藻生長繁殖,生物污染防治成為該藻規(guī)模化培養(yǎng)所面臨的問題。早期實驗表明,開放式培養(yǎng)過程中,大約4～5 d培養(yǎng)液中就會出現(xiàn)吞食雨生紅球藻的輪蟲,隨后導致整個培養(yǎng)失敗[7]。目前,用于抑制或殺滅敵害生物的藥物有化學藥品和中草藥兩大類[8],許多生產(chǎn)單位都進行過使用藥物殺滅藻液中敵害生物的試驗,但往往由于敵害生物對藥物的抵抗力比培養(yǎng)藻類強,效果多不理想。董美斌[9]等研究發(fā)現(xiàn),當培養(yǎng)基中碳銨濃度為250 mg/L時,24 h內(nèi)輪蟲數(shù)量下降到0。

本文首次通過紫外線照射野生型雨生紅球藻,獲得可以在含有較高碳銨濃度的培養(yǎng)基中生存的突變株,并通過對培養(yǎng)溫度、光照強度、p H值,以及氮、磷、鐵的濃度等參數(shù)對誘變株生長的影響進行研究,為雨生紅球藻的大規(guī)模培養(yǎng)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種

雨生紅球藻(Heamatococcus pluvialis),保存于中國海洋大學藻類遺傳實驗室。

1.2 培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基組成為(g/L):NaNO30.5,KH2PO40.02,MgSO40.1,CaCl20.08,Fe2EDTA 100μL/L(EDTA ·2Na 3.72 g/L,FeCl3·6H2O 4.17 g/L),微量元素100 μL/L(H3PO412.37 mg/L,MnSO4·H2O 84.51 mg/L, ZnSO471.89 mg/L,CuSO4·5H2O 62.42 mg/L,Na2MoO4·2H2O 7.26 mg/L,CoCl2·2H2O 4.76 mg/L, NiCl28.10 mg/L)。固體培養(yǎng)基為:液體培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂。正交實驗根據(jù)實驗需要調(diào)整氮、磷及鐵鹽的濃度。

1.3 培養(yǎng)條件

光源為日光燈,光照60μmol·m-2·s-1,光暗周期為12 h/12 h,溫度(22±1)℃。100 mL三角瓶,每瓶培養(yǎng)液的體積為50 mL。取對數(shù)生長期的藻以1∶5的比例接種,每天搖瓶3次。正交實驗根據(jù)實驗需要改變光照強度及溫度。

1.4 誘變方法及有效劑量

1.4.1 誘變方法 取對數(shù)期的雨生紅球藻藻液10 mL,5 000 r/min離心5 min,棄上清,用新鮮配制的培養(yǎng)液重新懸浮。取200μL藻液涂布在固體培養(yǎng)基上,30 W紫外燈20 cm處照射。照射時間為1、2、3、4、5、6、7及8 min,每種劑量做6個重復,未照射為對照。照射后避光放置12 h,之后于適宜條件下培養(yǎng)。

1.4.2 致死率計算 10 d后對平板上長出的藻落進行計數(shù),按下面公式計算致死率:致死率=(1-處理組藻落數(shù)/對照組藻落數(shù))×100%。根據(jù)照射時間和致死率曲線確定適宜的誘變時間[10]。

1.5 測定指標及測定方法

1.5.1 藻細胞密度的測定 使用UV22102PC型紫外2可見分光光度計測藻液在680 nm波長的吸光度,用血球計數(shù)板測定對數(shù)期的藻細胞密度。取一定量的藻液,用血球計數(shù)板計數(shù)得出細胞密度,測定所取藻液在680 nm處的吸光度,稀釋不同倍數(shù)所測定的值可做出細胞密度與吸光度的標準曲線。

1.5.2 生長速率的測定 特定生長率SGR=(lgNtlgN0)×100%/t,其中SGR為特定生長速率,t為培養(yǎng)時間,N0為初始OD值,Nt為培養(yǎng)t天后藻細胞的OD值[11]。

1.5.3 p H值的測定 用Orion Model 828型酸度計測定。

1.5.4 碳銨對雨生紅球藻的致死率 設固體培養(yǎng)基中碳銨的濃度為100、200、400、600及800 mg/L,將對數(shù)期雨生紅球藻涂布于平板上,10 d后對平板上長出的藻落進行計數(shù),重復3次,致死率計算方法同1.4.2。

1.6 突變株的篩選

將誘變后平板上長出的體積較大的藻落挑取至含有5 mL液體培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)10 d。在固體培養(yǎng)基中加入NH4HCO3,濃度為400 mg/L,將誘變后試管中的藻液涂布在固體培養(yǎng)基上,10 d后平板上長出的藻落即為目標突變株。將藻落挑至試管中培養(yǎng),光照60μmol·m-2·s-1,光暗周期為12 h/12 h,溫度(22±1)℃,待長成后,分別接種到100 mL的三角瓶培養(yǎng)。培養(yǎng)15 d,每48 h測定生長速率,選取生長速率快的藻株。

1.7 正交實驗設計

以原始培養(yǎng)基為基礎,營養(yǎng)鹽三因素各取3個水平,即NaNO3濃度為0.1,0.5及0.9 g/L,KH2PO4濃度為0.01,0.05及0.1 g/L,FeCl3·6H2O濃度為1.0, 3.0及5.0 mg/L,環(huán)境因子三因素各取3個水平,培養(yǎng)溫度為18,24及30℃,光照為10,30及100μmol· m-2·s-1,p H為6,8,10,利用L943的正交設計表進行實驗,以確定各因素對特定生長速率影響的顯著性和最佳組合。每隔48 h調(diào)1次培養(yǎng)基的pH值,培養(yǎng)的初始OD680為0.02,培養(yǎng)15 d。每組做3個平行,重復1次。

1.8 雨生紅球藻野生型及誘變株的生長情況及色素含量

1.8.1 生長情況的測定 活化2個藻種7 d,使其維持在對數(shù)生長期,生長狀態(tài)良好,將2種品系藻液的藻細胞密度調(diào)節(jié)為一致。250 mL三角瓶,100 mL培養(yǎng)基,取20 mL藻液接種,測量光密度,兩品系藻細胞初始密度都為0.02,培養(yǎng)20 d,48 h測一次細胞密度,3個平行,重復1次。

1.8.2 光合色素的測定 采用Arnon法進行測定。取1 mL藻液,5 000 r/min離心5 min,去上清,加入90%丙酮1 mL,震蕩提取,重復3次,收集上清,分別在663、646及470 nm波長下測吸光度,90%丙酮為空白。葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素的含量用以下公式計算:

Ca=12.21OD663-2.81OD646;

Cb=20.13OD646-5.03OD663;

Cx·c=(1000OD470-3.27Ca-104Cb)/229。

其中,Ca為葉綠素a的濃度,Cb為葉綠素b的濃度,Cx·c為類胡蘿卜素的總濃度(mg/L)。

2 結果與分析

2.1 紫外線照射的劑量效應

經(jīng)紫外線照射后,藻細胞的形態(tài)及運動能力發(fā)生了不同程度的變化。死亡細胞胞內(nèi)空間消失,原生質(zhì)體結構發(fā)散,呈淺綠色。隨著誘變處理時間延長,照射時間從1 min延長到5 min,雨生紅球藻細胞致死率隨著時間的延長而提高,有明顯致死效應。照射時間為3 min時,致死率為26.4%,處理5 min時致死率達到84.6%。將存活細胞挑入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h進行觀察,大多細胞緩慢轉動,少數(shù)局部擺動。誘變處理時間再延長,致死率增加緩慢,照射時間為8 min時,致死率為98.4%。實驗中采用5 min對雨生紅球藻進行誘變處理。

圖1 紫外線照射時間對雨生紅球藻的致死效應曲線Fig.1 The curve ofH.pluvialisexposure time to ultraviolet and the lethal effect

2.2 細胞密度與OD680關系曲線

由圖2可以看出,對數(shù)期的雨生紅球藻細胞密度與OD680值基本成正比,經(jīng)回歸分析,藻細胞密度與OD680之間呈線性關系,回歸方程為:y=0.125 8x+ 0.011 1,相關系數(shù)R2=0.995 2>0.735[12],說明相關關系顯著。所以只要測得吸光度,就可以直接求得藻細胞的生物量,從而大大簡化生物量的測定方法。

圖2 雨生紅球藻細胞密度與OD680值的線性關系Fig.2 The lineal relationship between cell density of H.pluvialisand OD680values

2.3 抗銨品系的篩選以及碳銨對雨生紅球藻野生型及誘變株的致死率

紫外線照射后,在含有濃度為400 mg/L的NH4HCO3的固體培養(yǎng)基上長出極少的藻落,挑選個體大的藻落于試管中培養(yǎng),待其長成后觀察,少數(shù)有貼壁及沉淀現(xiàn)象,目測挑選幾株生長狀況好的藻株進行測定,生長情況如下:雨生紅球藻誘變株19號的終細胞密度小于野生型,誘變株3號,7號及45號的終細胞密度大于野生型,與野生型出發(fā)株相比,誘變株3號生物量增長了4.0%,7號增長了13.9%,而45號的藻細胞終濃度增長了28.7%。由此可看出誘變株45號生長最快,而且其不貼壁,無沉底現(xiàn)象,將其視為本文的目標藻株,并進一步測定(下文中所出現(xiàn)的誘變株均為誘變株45號)。

圖3 野生型及各誘變株的生長情況比較Fig.3 The comparison of cell growth of wild type and mutant strain

碳銨對雨生紅球藻野生型及誘變株的致死率的實驗結果如圖4所示,培養(yǎng)基中N H4HCO3的濃度為200 mg/L時,野生型雨生紅球藻有一半的藻細胞死亡,突變株僅有1.85%的細胞死亡,死亡細胞質(zhì)壁間隙消失,呈淺綠色球形,失去鞭毛。當N H4HCO3的濃度為400 mg/L時,野生型死亡率達到88%,而突變株為21.5%。

根據(jù)文獻中所闡述的[9],當NH4HCO3的濃度為250 mg/L時,24 h內(nèi)輪蟲數(shù)量下降至0。由此,雨生紅球藻突變株在培養(yǎng)基中NH4HCO3的濃度為250 mg/L時可以存活,且能避免輪蟲等水生生物的影響。

圖4 不同濃度的NH4HCO3對雨生紅球藻野生型及突變株的致死率Fig.4 The mortality of NH4HCO3at different concentrations on the growth of wild type and mutant strain ofH.pluvialis

2.4 雨生紅球藻抗銨品系培養(yǎng)基初步優(yōu)化

對雨生紅球藻培養(yǎng)基進行考察,培養(yǎng)基中的硝酸鹽、磷酸鹽、FeCl3·6H2O以及環(huán)境因素對雨生紅球藻的生長均有一定的影響,所以選擇培養(yǎng)基中提供這3種營養(yǎng)元素的營養(yǎng)物質(zhì)進行濃度的優(yōu)化,為進一步精簡實驗步驟,增加實驗的分析性,初步優(yōu)化采用正交試驗法,結果如下列各表。

2.4.1 營養(yǎng)鹽的正交實驗 從表1的計算結果可以看出,藻細胞極差r值為Na2NO3>KH2PO4>FeCl3· 6H2O,可見Na2NO3對藻細胞生長影響最大,KH2PO4影響次之,FeCl3·6H2O濃度影響最小。不同的培養(yǎng)基組合中雨生紅球藻誘變株的特定生長率也有一定的差別,由表1可以看出培養(yǎng)基中營養(yǎng)鹽優(yōu)化組合為: NaNO3=100 mg/L,KH2PO4=10 mg/L,FeCl3· 6H2O=1.0 mg/L(其他同基本培養(yǎng)基),在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下,藻細胞培養(yǎng)15 d后生物量比在原始培養(yǎng)基中提高了19%。

由表2藻細胞特定生長速率方差分析可知:培養(yǎng)基中NaNO3對藻細胞生長影響最為顯著,KH2PO4影響顯著,FeCl3·6H2O影響不顯著。3個因素的F比分別為34.250、11.625、1.000,則NaNO3對藻細胞生長影響最大,KH2PO4次之,FeCl3·6H2O影響最小,與極差分析一致。

表1 NaNO3,KH2PO4和FeCl3·6H2O對誘變株藻細胞特定生長率影響的正交試驗設計及極差分析Table 1 Range analysis of mutant strain alga cell specific growth rat effected by NaNO3,KH2PO4and FeCl3·6H2O

表2 NaNO3,KH2PO4和FeCl3·6H2O對誘變株藻細胞特定生長速率的方差分析Table 2 Variance analysis of mutant strain alga cell specific growth rate effected by NaNO3,KH2PO4and FeCl3·6H2O

2.4.2 環(huán)境因子正交實驗 由表3極差分析可知,對雨生紅球藻誘變株生長而言:p H、光照強度、溫度極差分別為0.210、3.580和0.227。光照強度對雨生紅球藻誘變株的生長影響最大,溫度次之,p H值影響最小。不同的組合中藻細胞特定生長率SGR的差別很大,組合7中SGR為3.66,而組合6中的SGR達到8.49。從藻細胞的特定生長率SGR可知生長環(huán)境條件溫度為18℃,光照強度為100μmol·m-2·s-1,pH值為8。

表3 溫度、光照強度和p H值對誘變株藻細胞特定生長率正交試驗設計及極差分析Table 3 Range analysis of mutant strain alga cell specific growth rate effected by temperature,light and p H value

由表4藻細胞特定生長速率方差分析可知:光照強度對雨生紅球藻誘變株的生長影響極顯著,溫度的影響顯著,而培養(yǎng)基的p H值影響不顯著。3個因素的F比分別為1.000、270.887、47.507,則光照強度對藻細胞生長影響最顯著,溫度次之,p H影響最小,與極差分析一致。

表4 溫度、光照和p H值對誘變株藻細胞特定生長速率的方差分析Table 4 Variance analysis of mutant strain alga cell specific growth rate effected by temperature,light and p H value

2.5 雨生紅球藻野生型及誘變株的生長情況及色素含量

2.5.1 雨生紅球藻野生型及誘變株的生長狀況比較在相同培養(yǎng)條件下,誘變株藻細胞的終細胞密度明顯增加了,由圖5可以看出,雨生紅球藻誘變株抗銨品系的細胞密度遠大于野生型,培養(yǎng)至第20 d,誘變株的終細胞密度比野生型增加了36.9%。

圖5 野生型與誘變株生長狀況比較Fig.5 The comparison of cell growth of wild type and mutant strain

2.5.2 光合色素的含量 雨生紅球藻的光合色素主要是葉綠素a、b和類胡蘿卜素。葉綠素a廣泛地存在于所有綠色植物的葉綠體中,是類囊體膜的主要色素,葉綠素b是另一種重要色素,它總是伴隨葉綠素a存在于高等植物和綠藻中。研究發(fā)現(xiàn),紫外線輻射對藻液中葉綠素和類胡蘿卜素含量有降低作用,隨著輻射時間的延長,含量下降越快,相反,藻細胞中葉綠素和類胡蘿卜素含量全部上升,隨輻射時間的延長,上升幅度增加,在輻射5 min后,甚至增加了好幾倍。

圖6 野生型與誘變株的光合色素含量Fig.6 Photosynthetic pigment content of wild type and mutant strain

由圖6可以看出,誘變株的葉綠素a,葉綠素b及類胡蘿卜素的含量均大于野生型雨生紅球藻。葉綠素a/葉綠素b反映捕光色素復合體Ⅱ(L HCⅡ)在所有含葉綠素的結構中所占比例,該比值高說明捕光能力強,由此可以推斷,誘變株的光和效率要大于野生型雨生紅球藻。

3 討論與結論

氮是雨生紅球藻生長過程中的必需營養(yǎng)元素。在對雨生紅球藻生長的適宜氮濃度的研究中,Borowitz2 ka[13]等得出濃度范圍為0.5～1 g/L的硝酸鉀對雨生紅球藻生長更有利,Gong[14]等報道0.51 g/L的硝酸鈉為雨生紅球藻生長適宜的氮濃度,Fabregas[15]等實驗得出4 mmol/L左右的氮濃度是最有利雨生紅球藻生長,都與Borowitzka等的結果接近。而Orosa[16]等得出0.15 g/L的硝酸鈉才是雨生紅球藻生長的最適氮濃度,翟興文[17]等研究報道硝酸鉀的適宜濃度是1 g/L,各種結果都相差甚遠。

Borowitzka[13]等認為盡管磷對雨生紅球藻的生長是必不可少的,但不同濃度的作用效果差異并不明顯,翟興文[17]等研究報道磷酸二氫鉀濃度為0.02～0.04 g/L時是適宜雨生紅球藻生長的。

鐵是人們最早發(fā)現(xiàn)的微量元素,在原核生物和真核生物的生命活動中具有不可替代的功能,位居植物必需微量元素的首位[18]。在浮游植物的生長過程中,電子傳遞,氧的新陳代謝,氮的吸收利用,葉綠素的光合作用,呼吸作用等都受鐵的影響。單因子實驗表明較高濃度的FeCl3·6H2O對藻的生長有促進作用,但正交實驗結果卻相反,這可能是各因子間相互影響的結果。

光照是影響雨生紅球藻生長的重要因素之一。Boussiba[19]等認為雨生紅球藻適宜生長的光強較弱,范圍在30～90μmol·m-2·s-1之間。近幾年,不同研究者對雨生紅球藻生長的最適光強的看法差別很大,在雨生紅球藻研究的實驗中采用的光強也多種多樣。本實驗得出的結論是光照強度100μmol·m-2·s-1時藻細胞生長最快,但是這不利于藻細胞的高密度積累,因為高光強會誘導蝦青素的產(chǎn)生,培養(yǎng)至17 d時會出現(xiàn)紅色厚壁細胞。

Hata[20]等認為,雨生紅球藻最適生長的p H值為中性至微堿性。張寶玉等[21]研究了4株雨生紅球藻,得出它們的最適的p H值多數(shù)在7.0～8.0的范圍內(nèi),與本實驗的結果相近。

實驗證明,雨生紅球藻誘變株可以在含有NH4HCO3濃度為400 mg/L的培養(yǎng)基中存活,且生長速度較原始株有所提高,培養(yǎng)20 d后生物量比出發(fā)株提高了36.9%,色素含量較野生型也有一定提高。誘變株初步優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為:NaNO30.1 g/L,KH2PO40.01 g/L,FeCl3·6H2O 1.0 mg/L,p H=8.0,光照強度100μmol·m-2·s-1,溫度18℃。

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UV Mutagenesis and Anti2Ammonium Strain Selection of Haematococcus pluvialis

ZHANG Li1,2,FAN Ming2Hao1,2,SONG Yi2Min1,2,ZHANG Xue2Cheng2
(1.College of Chemical Engineering,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042,China;2.College of Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

AHaematococcus pluvialisstrain that can stands in 400 mg/L NH4HCO3was obtained by UV mutagenesis and selection.In order to determine the optimal cultural conditions,effects of nutrition ele2 ments(nitrate,phosphate and ferric)and other ecological elements(p H value,temperature and light in2 tensity)on the growth ofHeamatococcus pluvialisof mutant strains,and orthogonal tests with three ele2 ments and three levels were conducted.Also,the cell growth and photosynthetic pigment content of wild type and mutant strain were compared.Results uncovered that the optimal culture conditions of mutant strain were determined as follows:NaNO3,KH2PO4and FeCl3·6H2O concentrations 0.1 g/L,0.01 g/L and 0.001 g/L,respectively,and p H8.0,light intensity 100μmol·m-2·s-1and temperature 18℃. Under these conditions,the biomass ofHeamatococcus pluvialisincreased remarkably.

Heamatococcus pluvialis;ultraviolet;mutagenesis;strain selection;orthogonal tests

book=2011,ebook=6

S948.8

A

167225174(2011)062068207

責任編輯 于 衛(wèi)

國家自然科學基金項目(30471317)資助

2010203210;

2010209213

張 麗(19852),女,碩士生。E2mail:swing_lily@hotmail.com

33通訊作者:E2mail:xczhang@ouc.edu.cn