朱艷婷， 李定旭， 時景燕， 王濤濤， 王振輝

（河南科技大學(xué)林學(xué)院植物保護系，洛陽 471003）

桃小食心蟲高致病力白僵菌菌株篩選

朱艷婷， 李定旭＊， 時景燕， 王濤濤， 王振輝

（河南科技大學(xué)林學(xué)院植物保護系，洛陽 471003）

對來源于不同地點或寄主的14株球孢白僵菌進行僵蟲率、在蟲體上菌絲生長時間、產(chǎn)孢時間及單蟲產(chǎn)孢量測定，綜合評價各菌株對桃小食心蟲幼蟲的致病力，選擇較好的菌株進行毒力測定。結(jié)果表明：基于僵蟲率、菌絲生長時間、產(chǎn)孢時間及單蟲產(chǎn)孢量4個指標，篩選出3株具有較強致病力的優(yōu)良菌株Bb7、Bb9和Bb14；在孢子濃度為1.0×107孢子／mL時，對桃小食心蟲幼蟲的致死率分別為73.33%、77.78%和80.00%，LT50分別為8.45、7.49、8.42d；LC50分別為1.76×105、3.03×106、2.10×105孢子／mL。

桃小食心蟲； 白僵菌； 僵蟲率； 毒力測定

桃小食心蟲（Carposina sasakiiMatsumura）屬于鱗翅目（Lepidoptera）蛀果蛾科（Carposinidae），是我國北方果樹生產(chǎn)中危害最大、發(fā)生最普遍的食心蟲類害蟲，可為害蘋果、棗、梨等10多種果樹的果實［1］。被害果實多呈畸形的“猴頭果”，果肉常被食空，果內(nèi)充滿蟲糞，使果實失去商品價值。在桃小食心蟲的綜合治理實踐中，化學(xué)防治仍然是最重要的措施。但化學(xué)防治因其抗藥性、殺傷天敵、污染環(huán)境和農(nóng)藥殘留等而備受批評，同時，出于對食品安全的考慮以及對環(huán)境保護的擔(dān)心，人們迫切需要尋求能夠替代化學(xué)防治的措施，因此，對生物防治的研究越來越受到重視。

球孢白僵菌［Beauveria bassiana（Bals.）Vuill］是一類廣譜性昆蟲病原真菌，研究表明此菌能侵染15個目149個科的700多種昆蟲［2］。在自然環(huán)境里有很多昆蟲因病而死亡，其中以真菌致病最多（占60%以上），由白僵菌引起的占21%［3］。Lacey和Samuels等曾指出不同種或同種不同菌株的殺蟲活性存在很大的差異［4－5］，并且菌株的殺蟲活性還存在明顯的地區(qū)適應(yīng)性［6］。因此，利用病原真菌防治害蟲的重要基礎(chǔ)工作仍然是篩選高效菌種或菌株。作者測定了采自不同地點和寄主的14株白僵菌菌株對桃小食心蟲幼蟲的侵染能力，期望能夠篩選出對桃小食心蟲幼蟲毒力強的菌株，為進一步探索其應(yīng)用于田間防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

試蟲采自河南省洛陽市郊區(qū)疏于管理的蘋果園。2009年8月自園中收集帶有桃小食心蟲為害癥狀的蘋果，帶回室內(nèi)后獲得末齡脫果幼蟲；在指形管（18mm×120mm）中裝入25～30mm厚的滅菌濕潤細沙（含水量為14%），將幼蟲單頭裝入指形管后放入人工氣候箱（PQX-450B-30H，寧波萊?？萍加邢薰荆﹥?nèi)，保持溫度（25±1）℃、RH85%±7%、光周期L∥D＝15h∥9h，待幼蟲結(jié)繭、化蛹。成蟲羽化后，將單對成蟲放于養(yǎng)蟲籠（直徑100mm、高100mm）中，籠頂蓋濕紗布保濕，用10%的蜂蜜水補充營養(yǎng)，籠內(nèi)放置具毛茬的濾紙片供其產(chǎn)卵。每天上午定時收取卵卡，當(dāng)卵剛出現(xiàn)黑頭時，將卵卡剪成帶卵的小片；將新鮮、無農(nóng)藥殘留、大小基本一致的蘋果用清水洗凈，用瓊脂將卵卡小片貼在蘋果萼洼處，每果接卵5～8粒，并將蘋果置于（25±1）℃、RH85%±7%、光周期L∥D＝15h∥9h的條件下培養(yǎng)，待桃小食心蟲幼蟲脫果后用于測定。

1.2 供試菌株

供試菌株是從河南、江西、廣西、福建等地所收集而來，詳見表1。

表1 不同白僵菌菌株的來源與寄主

1.3 供試菌株的培養(yǎng)

所有的供試菌株均采用PDA進行培養(yǎng)。將復(fù)壯后的白僵菌接種到PDA平板培養(yǎng)基上，于（25±1）℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)產(chǎn)生大量分生孢子（培養(yǎng)10～12d）時用于制備白僵菌菌液。用移液管吸取0.2%吐溫-80溶液5mL置產(chǎn)生大量孢子的白僵菌平板中，左右搖動5min后，將其溶液移至裝有定量0.2%吐溫-80溶液的容器中充分散開。用血球計數(shù)板在顯微鏡下鏡檢孢子數(shù)，根據(jù)實際需要調(diào)整菌液濃度。

1.4 處理方法

各菌株均以孢子濃度為1.0×107孢子／mL的菌液進行測定。供試桃小食心蟲幼蟲的體重均為20～30mg，每處理測定15頭幼蟲，設(shè)3次重復(fù)，以0.2%吐溫-80溶液作對照。將幼蟲浸入相應(yīng)的菌液5s，取出后用吸水紙吸去多余水分，放入已分裝好濕沙（含水量為14%）的指形管中并稱重。將試管置于（25±1）℃、RH85%±7%、光周期L∥D＝15h∥9h的人工氣候箱內(nèi)，每5d對各指形管校正含水量。每天觀察并詳細記錄桃小食心蟲的行為反應(yīng)、菌絲生長及產(chǎn)孢情況。從處理幼蟲到蟲體上出現(xiàn)菌絲所需時間記為菌絲生長時間（GD）；當(dāng)蟲（繭）體出現(xiàn)菌絲（落）時，記為僵蟲，直到產(chǎn)生分生孢子所需時間記為產(chǎn)孢時間（CD）；選取各菌株處理第7天時所產(chǎn)生的僵蟲，待產(chǎn)孢10d后測定單蟲產(chǎn)孢量（CM）。將所選僵蟲分別放入1mL 0.2%吐溫-80溶液中，振蕩5min后，用血球計數(shù)板測定孢子數(shù)量；每頭蟲（繭）測定兩個視野的孢子數(shù)量，并計算產(chǎn)孢量。對20d后沒有正常羽化的繭進行解剖，進一步確定僵蟲數(shù)量。

1.5 毒力測定

將培養(yǎng)10～12d的菌株，用0.2%吐溫-80制成孢子濃度為1.0×108、1.0×107、1.0×106、5.0×105、1.0×105、5.0×104孢子／mL的菌液，以0.2%吐溫－80作對照。每個濃度設(shè)3個重復(fù)，每重復(fù)處理30頭幼蟲，置于溫度（25±1）℃、RH 85%±7%、光周期為L∥D＝15h∥9h的人工氣候箱內(nèi)，每24h檢查1次僵蟲數(shù)，直到對照組不再有成蟲羽化為止。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

用SPSS17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進行LSD多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株對桃小食心蟲的致病力

桃小食心蟲幼蟲經(jīng)白僵菌菌液處理后，在感染白僵菌初期，未結(jié)繭的幼蟲活動量明顯減少，且蟲體由桃紅色變暗紅色，大約2d后開始出現(xiàn)菌絲；正常結(jié)繭的則在6～7d時長出菌絲；而對照組的蟲體（繭）上未出現(xiàn)菌絲（落），并正常羽化。桃小食心蟲幼蟲的死亡率隨時間延長而增加（圖1）。

圖1 不同菌株對桃小食心蟲幼蟲的累計致病力

由圖1可知，不同白僵菌菌株對桃小食心蟲幼蟲的致病力差異顯著（p＜0.05），隨著時間推移各菌株的僵蟲率增加，處理15d后僵蟲率基本穩(wěn)定。處理第5天，Bb4菌株的僵蟲率最高，為37.78%，其次為Bb5菌株，33.33%；處理第10天，Bb14的僵蟲率最高為75.56%，其次Bb9、Bb7分別為73.33%、68.89%，這3個菌株的僵蟲率無顯著差異，但顯著高于其他菌株的僵蟲率；處理第15天，Bb14的僵蟲率最高為80.00%，其次Bb9、Bb7分別為77.78%、71.11%，這3個菌株的僵蟲率仍無顯著差異，但與其他菌株的僵蟲率差異顯著；處理第20天，各菌株的僵蟲率幾乎不再增加，僅Bb7菌株的僵蟲率略有增加，達73.33%。

2.2 不同菌株在蟲體上的菌絲生長時間、產(chǎn)孢時間及單蟲產(chǎn)孢量

各菌液處理桃小食心蟲幼蟲后，以僵蟲率、菌絲生長時間、產(chǎn)孢時間、單蟲產(chǎn)孢量為指標（圖2），對該菌株進行綜合評價。

由圖2分析得出，各菌株的菌絲生長時間存在顯著差異（p＜0.05）。其中，Bb4、Bb6兩菌株菌絲生長時間最短，分別為6.63、6.76d，而Bb11、Bb12菌株菌絲生長時間最長，達9.89、9.56d；Bb4、Bb6與Bb11和Bb12菌株的菌絲生長時間差異顯著，與其他菌株間差異不顯著。不同菌株菌絲生長時間由短到長排列為：Bb4＜Bb6＜Bb13＜Bb7＜Bb5＜Bb2＜Bb9＜Bb14＜Bb1＜Bb8＜Bb3＜Bb10＜Bb12＜Bb11。

圖2 不同白僵菌菌株的菌絲生長時間、產(chǎn)孢時間、單蟲產(chǎn)孢量比較

各菌株的產(chǎn)孢時間顯著不差異（p＞0.05），以Bb3菌株產(chǎn)孢時間最長，達6.56d，Bb14最短，僅3.63d。不同菌株產(chǎn)孢時間由短到長排列為：Bb14＜Bb9＜Bb2＜Bb4＜Bb11＜Bb7＜Bb8＜Bb6＜Bb5＜Bb10＜Bb12＜Bb1＜Bb13＜Bb3。

根據(jù)各菌株的單蟲產(chǎn)孢量比較分析得：Bb7的產(chǎn)孢量最高，達到6.45×107孢子／mL，顯著高于其他各菌株的產(chǎn)孢量（p＜0.05）。Bb8、Bb9、Bb10和Bb14菌株的產(chǎn)孢量差異不顯著，與Bb4、Bb5、Bb11和Bb12菌株的產(chǎn)孢量差異顯著。不同菌株的單蟲產(chǎn)孢量由高到低排列為：Bb7＞Bb10＞Bb12＞Bb8＞Bb9＞Bb14＞Bb3＞Bb1＞Bb2＞Bb6＞Bb13＞Bb4＞Bb5＞Bb11。

根據(jù)不同菌株的僵蟲率、菌絲生長時間、產(chǎn)孢時間、單蟲產(chǎn)孢量各項指標的優(yōu)劣順序給予1～14的評分，各指標得分相加得出該菌株的最終評分。選得分最低的Bb7、Bb9、Bb14菌株進行下一步的毒力測定。

2.3 不同濃度的孢子懸浮液對桃小食心蟲室內(nèi)毒力測定

由圖3可知，白僵菌Bb7、Bb9、Bb14菌株的6個濃度梯度的菌液對桃小食心蟲幼蟲均有明顯的致死作用，并且致病力隨菌液濃度的增大而增強。其中Bb7、Bb9、Bb14菌株孢子濃度為108孢子／mL時，桃小食心蟲幼蟲的累計校正死亡率分別達到87.78%、81.11%和90.00%。

圖3 白僵菌Bb7、Bb9、Bb14菌株不同濃度梯度與桃小食心蟲幼蟲死亡率的毒力回歸線

根據(jù)毒力測定的數(shù)據(jù)，計算出3株白僵菌對桃小食心蟲的致死中時和致死中濃度如表2和表3。

由表2和表3可知：在分生孢子濃度為1.0×107孢子／mL時，Bb9菌株對桃小食心蟲幼蟲的致死中時最短，為7.49d，而Bb7、Bb14菌株均為8.4d左右，但3個菌株之間無顯著差異，因其95%置信區(qū)間相互重疊。Bb7菌株對桃小食心蟲幼蟲的致死中濃度最低，為（1.76±1.09）×105孢子／mL，其次為Bb14菌株，其致死中濃度為（2.10±1.03）×105孢子／mL，兩者均顯著低于Bb9菌株。Bb7與Bb14之間無顯著差異。

表2 3株白僵菌對桃小食心蟲幼蟲的致死中時

表3 3株白僵菌對桃小食心蟲幼蟲的致死中濃度

3 小結(jié)與討論

本文在室內(nèi)條件下，基于僵蟲率、菌絲生長時間、產(chǎn)孢時間及單蟲產(chǎn)孢量4個指標，從14株供試白僵菌中篩選出3株對桃小食心蟲具有較高致病力的菌株Bb7、Bb9、Bb14，進而測定了這3株白僵菌對桃小食心蟲幼蟲的毒力。結(jié)果表明，這3株白僵菌對桃小食心蟲幼蟲有較強的致病性。僵蟲率體現(xiàn)菌株致病力的強弱，菌絲生長時間的長短顯示出菌株致死速度的快慢，而產(chǎn)孢時間的長短和單蟲產(chǎn)孢量的多少可以體現(xiàn)該菌株在田間能產(chǎn)生二次感染源的速度快慢和強弱。從4個指標綜合評定能更全面的體現(xiàn)菌株的綜合優(yōu)良性。

從室內(nèi)毒力測定結(jié)果看，Bb7、Bb9、Bb14菌株在108孢子／mL濃度下對桃小食心蟲幼蟲均具有較高的致死率，但Bb7和Bb14菌株的致死中濃度顯著低于Bb9菌株，這與菌株篩選的結(jié)果不完全一致，其原因在于菌株篩選是單濃度試驗，而毒力測定是濃度梯度試驗。毒力回歸方程顯示Bb9菌株的斜率最大，說明Bb9菌株的致死率對孢子濃度變化較為敏感。根據(jù)室內(nèi)菌株篩選試驗結(jié)果，我們推測：在篩選高致病力菌株時，最簡便的方法是從當(dāng)?shù)刈匀患纳募闹魃戏蛛x；若當(dāng)?shù)仉y以獲得自然寄生的原寄主，則從其他寄主上亦有可能獲得較高致病力的菌株。何余容等［2］、李正躍等［7］以及張立欽［8］的結(jié)果也印證了這一推測。

一般情況下，菌株前3d致病力相對較差，原因是接種前1～3d為蟲生真菌孢子的潛伏期，這與龍明華等［9］報道用藥后1～3d藥效不明顯，用藥后5～7d藥效明顯提高結(jié)果一致。這并不影響白僵菌的致死效果，因桃小食心蟲的蛹期在20～26℃時為9.50～16.71d［10］，一般為10～12d。但有關(guān)該菌株在大田的防治效果需做進一步的試驗研究。

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Screening of the isolates ofBeauveria bassianawith high pathogenicity toCarposina sasakiilarvae

Zhu Yanting， Li Dingxu， Shi Jingyan， Wang Taotao， Wang Zhenhui
（Department of Plant Protection，College of Forestry，Henan University of Science and Technology，Luoyang471003，China）

This study dealt with biological characteristics of 14isolates ofBeauveria bassianacollected from different locations and hosts.Among the 14 isolates tested，significant difference was found in mortality of the pest，mycelium growth，sporulating time，spore yield and pathogenicity againstC.sasakiilarvae.Through comprehensive comparisons，the isolates Bb7，Bb9 and Bb14 were selected as the most suitable isolates for further study due to their higher pathogenicity，with mortalities of 73.33%，77.78%and 80.00%，respectively，faster mycelium growth and higher spore yield.The results showed that the LT50values for Bb7，Bb9 and Bb14 were 8.45 d，7.49 d and 8.42 d，and their LC50values were 1.76×105，3.03×106and 2.10×105spores／mL，respectively.

Carposina sasakii；Beauveria bassiana； mortality；toxicity test

S 476.12

A

10.3969／j.issn.0529-1542.2011.05.030

2010-10-19

2010-11-24

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（200803006）

＊ 通信作者 E-mail：lldingxu＠sohu.com